نظام الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد لدراسة الغزو وتقييم المداواة في سرطان المثانة

وتمثل العمليات التي تحكم غزو سرطان المثانة فرصاً للعلامات البيولوجية والتنمية العلاجية. هنا نقدم نموذجا غزو سرطان مثانة الذي يتضمن الثقافة ثلاثي الأبعاد من الماغنيسيوم الورم والوقت الفاصل بين التصوير والفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الأسلوب مفيد لتحديد ملامح عملية الغازية وفحص العوامل العلاجية.

يعد التقدم الغازي محددا حاسما للنتائج السريرية في مرضى سرطان المثانة. سنصف هنا طريقة بسيطة في المختبر ، والتي تستخدم كرويات الورم المتولدة باستخدام خطوط الخلايا أو الأورام الأولية لدراسة الغزو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا قادرون على مراقبة عملية غزو السرطان في الوقت الفعلي ، وكذلك استخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي لاستجواب العينات في نهاية التجربة.

يمكن تصميم هذه التقنية لدمج أنواع أخرى من الخلايا ، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا المناعية. يمكن استخدامه أيضا لاختبار المركبات التي قد تكون مفيدة لمنع الغزو. تشمل العوامل الحاسمة للنجاح تحسين تكوين الورم الكروي وتضمينه في استخدام الكولاجين المجهري المناسب مع مسافة العمل الصحيحة وإجراءات التلوين المناعي المناسبة.

لبدء توليد الكرات من خطوط الخلايا ، قم بزراعة خلايا سرطان المثانة البشرية في ظل ظروف زراعة خلايا الالتصاق التقليدية. قبل يوم واحد من التجربة ، قم بتربسين الخلايا وتوزيع 1،000،000 خلية في ثلاثة ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا على كل بئر من ستة ألواح آبار. بعد ذلك ، احتضان الخلايا في ظروف التعلق المنخفضة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل.

لتوليد الكرات الكروية من الأورام الأولية ، اجمع وغسل قطع الورم المكعبة 0.5 ملم في خمسة ملليلتر من PBS المثلج. الطرد المركزي لقطع الورم عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اجمع قطع الورم عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

ثم قم بإزالة المادة الطافية وأضف خمسة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS. انقل خليط الوسائط الكروية للورم إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية مكونة من ستة آبار. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل.

أولا ، قم بتخفيف الكولاجين من النوع الأول في DMEM المكمل بنسبة 10٪ FBS لعمل خليط ملليغرام لكل ملليلتر. ثم قم بتغطية آبار شريحة الغرفة بسرعة بالخليط. حافظ على شريحة الغرفة ثابتة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتقطيع 500 ميكرولتر من الوسائط الكروية برفق من لوحة التثبيت المنخفضة للغاية إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. ثم اترك الكرويات تستقر في قاع الأنبوب لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الأنبوب.

ثم أضف بسرعة 500 مل من خليط الكولاجين الطازج DMEM إلى الكرات الكروية. الماصة لأعلى ولأسفل لخلط الكرات والكولاجين برفق. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من خليط الكولاجين الكروي إلى آبار شريحة الغرفة المطلية بالكولاجين.

اسمح لمصفوفة الكولاجين التي تحتوي على الكروية بالتصلب تماما. بعد أن تصلب مصفوفة الكولاجين ، أضف ملليلتر واحد من DMEM المكمل ب FBS إلى كل بئر من شرائح الغرفة. ثم احتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.

قم بإعداد المجهر متحد البؤر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتأكد من وصول غرفة المناخ إلى 37 درجة مئوية ومزودة ب 5٪ CO2. ثم انقل شريحة الغرفة إلى محول شريحة المجهر. باستخدام هدف منخفض الطاقة ، حدد موقع الكرات ذات الأهمية ثم ابدأ التصوير بهدف عالي الطاقة وقم بإجراء تصوير بفاصل زمني لمدة 24 إلى 72 ساعة.

أولا ، استخدم ملقطا صغيرا لرفع كتلة هلام الكولاجين والكرويات من شريحة الغرفة. ثم ضع كتلة جل الكولاجين في قالب نسيجية بلاستيكي. اشطف كتلة جل الكولاجين باستخدام 1x PBS لفترة وجيزة.

وقم بإصلاحه باستخدام 4٪ PFA و PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل كتلة جل الكولاجين ب 1.5 مل من 1x PBS على شاكر لمدة 15 دقيقة. ضع طبقة رقيقة من مركب OTC على قاع قالب الأنسجة البلاستيكي الجديد.

ثم ضع كتلة جل الكولاجين الثابتة والمغسولة فوق مركب OTC قبل ملء باقي القالب بعناية بمركب OTC. احتفظ بالقالب عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتجميد القالب على طبق بتري 100 ملم يطفو على النيتروجين السائل وتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

انقل كتلة العينة المجمدة إلى حجرة 20 درجة مئوية تحت الصفر في ناظم البرد. ثم قم بإجراء التقسيم المجمد التقليدي بفاصل مقطع سبعة ميكرومترات. بعد ذلك ، جفف الشرائح بالهواء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم تخلل العينات لمدة 15 دقيقة باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.5٪ Triton X-100. بعد ذلك ، اغسل العينات باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. ثم تطويق العينات بقلم حاجز كاره للماء.

عالج العينات بمحلول مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع 40 ميكرولترا من محلول يحتوي على الجسم المضاد الأولي على كل عينة. احتضن الشرائح لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 15 دقيقة لكل غسلة. بعد ذلك ، ضع 40 ميكرولترا من محلول يحتوي على الجسم المضاد الثانوي على كل عينة. ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 15 دقيقة لكل غسلة.

تلطخ العينة بمحلول Hoechst 33342 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل العينات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. قم بتركيب العينات بوسط التثبيت وقم بتغطيتها بزلات غطاء.

أخيرا ، اترك الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة قبل إجراء الفحص المجهري متحد البؤر. في هذا البروتوكول ، تشكلت كرويات ورم سرطان المثانة الغازية من خطوط الخلايا والأورام الأولية. يوضح فيديو الفاصل الزمني التمثيلي غزو الورم الكروي لسرطان المثانة في مصفوفة الكولاجين.

يوضح فيديو الفاصل الزمني التمثيلي السلوك الغازي ل GFP المسمى سرطان المثانة الكروي الكروي بمفرده أو المزروع بشكل مشترك مع الخلايا الليفية المسماة RFP. لإثبات جدوى استخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي لعلامات البروتين ، تم إصلاح الكرويات وتقسيمها وتلوينها في 24 أو 72 ساعة. يظهر عرض التكبير الأعلى للكبوتات الكروية UM-UC-14 تلطيخا للبروتين المرتبط بتوسع الشعيرات من المجموعة D.

تعبر الخلايا شديدة التوغل المنتشرة من الكرات الكروية UM-UC-18 بعد 24 ساعة من الغزو عن مستوى عال من Vimentin ، وهي علامة على الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة. هذا الاختبار مفيد للشاشات المحدودة للمثبطات الدوائية لغزو سرطان المثانة. يستخدم السيتوكالاسين D هنا لتمثيل التثبيط الدوائي للغزو.

نصف هنا نموذجا يسمح بالملاحظة في الوقت الفعلي لغزو سرطان المثانة. هذا النظام قابل لدمج العديد من المكونات اللحمية والخلوية ، مما يسمح للمحققين بتلخيص البيئة المكروية للأنسجة بشكل أفضل حيث يحدث غزو سرطان المثانة. لا يوفر هذا النظام أداة مفيدة لدراسة الغزو في بيئة ثلاثية الأبعاد فحسب ، بل إنه مناسب أيضا للفحص المحدود للمركبات الدوائية التي لديها القدرة على منع غزو الخلايا السرطانية.