Name: تحريض غشائي التمايز في خلايا القلب السلف تحت ظروف المصل منخفضة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: اكتشف بروتوكولاً فعالاً لتحريض التمايز البطاني في خلايا القلب السلف CPCs باستخدام مصل منخفض وكثافة خلايا منخفضة على ركائز اللامينين. تدعم هذه الطريقة دراسات التجدد القلبي وتطبيقات العلاج الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون لورينز فيرا للدعم المفيد الذي قدمته خلال التجارب والموظفين من "مرفق التدفق الخلوي" من إدارة الطب الحيوي (DBM) وجامعة بازل في مستشفى الجامعة. وأيد هذا العمل البقاء في مسار البرنامج من جامعة بازل (موشيزوكي ميتشيكا). م. غابرييلا كوستر معتمد بمنحه من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" (المنحة رقم 310030_156953).

<ol><li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li>
<li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).</li>
<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li>
<li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes%3A+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li>
<li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1%2B+stem%2Fprogenitor+cell+in+adult+murine+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930(2015).</li>
<li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing%2C+clonogenic%2C+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium%2C+improving+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li>
<li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+c-kit%28pos%29+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li>
<li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium%3A+homing%2C+differentiation%2C+and+fusion+after+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li>
<li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter%2C+Abcg2%2C+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31-+but+Not+CD31%2B+cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+isl1%2B+cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li>
<li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li>
<li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+migration+of+Sca1%2B%2FCD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li>
<li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic%3A+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-kit+receptor%2C+stem+cell+factor%2C+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li>
<li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li>
<li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li>
<li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195(2009).</li>
<li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669(2011).</li>
<li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li>
<li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li>
<li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors%2C+matrices%2C+and+forces+combine+and+control+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مزايا هذا البروتوكول:
يوفر هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لتكلفة النقرة. ووجدنا أن تركيز المصل منخفضة، والخلية منخفضة الكثافة يمكن تحسين كفاءة التمايز بطانية، حيث ثبت LN الركازة أكثر ملاءمة من الجبهة الوطنية في ظل هذه الظروف. استخدمنا نوعين متميزين من تكلفة النقرة: الفئران Cpc، التي استخدمت بطريقة شبيهة بخط الخلية، والماوس SP-Cpc، التي كانت معزولة وتوسيعها. جدير بالذكر أن البروتوكول تنطبق على كلا النوعين Cpc. الحالية تسمح التقنيات العلماء عزل وتوسيع Cpc الأولية من الفئران المحورة وراثيا ومن...

دعم الدراسات التي أجريت مؤخرا وجود خلايا السلف القلب المقيم (Cpc) في قلب الثدييات الكبار1،2،3، وتكلفة النقرة يمكن أن يكون مصدرا مفيداً لعلاج الخلايا بعد إصابة القلب4، 5-وباﻹضافة إلى ذلك، Cpc الموسعة قد تقدم نموذجا مثمرا لفحص المخدرات والتحقيق في آليات المرض عند معزولة من مرضى القلب نادرة، أو من المرض كل نماذج6،7.
Cpc معزولة عن قلب الكبار تمتلك الجذعية/السلف خلية الخصائص1،2،،من38 كما مولتيبوتينت، كلونوجينيك، ولديها القدرة على التجدد الذاتي. ومع ذلك، هناك العديد من السكان مختلفة (الفرعية) لتكلفة النقرة نستعرض الملامح ماركر السطحية المختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال، ج-كيت، 1 هيئة الأوراق المالية، وغيرها، أو استردادها بواسطة تقنيات العزل المختلفة (الجدول 1). وكانت عدة بروتوكولات الثقافة والتمايز المنشأة1،2،،من89،10،،من1112، 13،،من1415،16،،من1718. وتختلف هذه البروتوكولات معظمها يتعلق بعامل النمو ومحتوى مصل الدم، التي يتم تعديلها وفقا للغرض من استزراع والتي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج والنتائج، بما في ذلك كفاءة التمايز.
تقنيات العزل القائم على علامة:
Cpc يمكن عزل استناداً إلى علامة سطحية محددة تعبير1،2،،من89،10،11،12،13 ،14،،من1516،،من1718. تشير الدراسات السابقة إلى أن ج-كيت والهيئة-1 قد تكون علامات أفضل لعزل المقيم Cpc1،،من1114،،من1920. نظراً لأن أيا من هذه العلامات محددة حقاً لتكلفة النقرة، عادة ما يتم تطبيق تركيبات من علامات مختلفة. على سبيل المثال، حين Cpc التعبير عن مستويات منخفضة من مجموعة ج21، ج-كيت أيضا أعرب عن سائر أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا ماست22،23من خلايا بطانية، و الخلايا الجذعية المكونة للدم/السلف24. وهناك مشكلة إضافية هي حقيقة أن ليس كل علامات يتم التعبير عنها عبر جميع الأنواع. وهذا هو الحال بالنسبة للهيئة-1، الذي يعرب بالماوس ولكن ليس في الإنسان25. ولذلك، استخدام البروتوكولات التي تكون مستقلة عن علامات العزلة قد يكون من المفيد النظر إلى التجارب السريرية والدراسات باستخدام عينات بشرية.
تقنيات عزل علامة مستقلة:
وهناك العديد من التقنيات الرئيسية لعزل الحزب الشيوعي الصيني، التي هي أساسا مستقلة للتعبير علامة السطحية، ولكن التي يمكن صقلها بالتحديد على التوالي اﻷفخاذ علامة إيجابية محددة حسب الحاجة (انظر أيضا الجدول 1). (1) تقنية السكان (SP) الجانب اتسم أصلاً في عدد سكان بدائية من الخلايا الجذعية المكونة للدم استناداً إلى القدرة على افلوكس صبغ الحمض النووي هويشت 3334226 ملزم ATP كاسيت (ABC) الناقلين27. تم عزلة بواسطة مجموعات مختلفة القلب SP الخلايا وذكرت للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مع بعض الاختلافات الطفيفة بين التقارير2،8،،من1314. (2) مستعمرة-تشكيل وحدة تنتجها الخلايا الليفية الخلايا (زيمبابوي-خ) أصلاً تم تعريفها على أساس في خلية stromal الوسيطة (MSC)-مثل النمط الظاهري. تستزرع MSCs معزولة عن الأطباق للحث على تشكيل مستعمرة. مثل مستعمرة-تشكيل لجنة السلامة البحرية مثل زيمبابوي-خ يمكن أن تكون معزولة عن قلب الكبار وهي قادرة على تفرق في الأنساب القلب15. (3) المستمدة من كارديوسفيري الخلايا (CDC) هي خلايا مفردة مشتقة من مجموعات من الخلايا التي نمت من خزعات الأنسجة أو اكسبلانتس28،29،،من3031. مؤخرا تبين أن معظمها CD105+/CD90 معارض جزء الخلية/c-kit– –كارديوميوجينيك والتجدد المحتمل32.
هنا، باستخدام SP-Cpc المعزولة من الفئران، نقدم بروتوكول لاستحثاث كفاءة النسب غشائي استناداً إلى دراسة سابقة في Cpc الجرذ والفأر SP-Cpc33. ويتضمن البروتوكول تعديلات محددة للثقافة وأسلوب التوسع فيما يتعلق بكثافة الخلية، ومحتوى مصل المتوسطة، والركيزة. فإنه يمكن تطبيقها ليس فقط على الماوس SP-Cpc ولكن للحصول على أنواع مختلفة من تكلفة النقرة لهذا الغرض لحفز التحول مصير من تضخيم للحزب الشيوعي الصيني غشائي المرتكبة، سواء كان ذلك نظراً لزرع هذه الخلايا أو استعمالها للدراسات الميكانيكية في المختبر .

<table><tbody><tr><td><قوي > ثقافة متوسطة < / قوي> وسط</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) ThermoFisher</td><td></td> <td># 12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / خليط المغذيات F12 Ham</td><td>Merck</td> <td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P / S)</td> <td>ThermoFisher</td> <td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bee مصل (FBS)</td><td>هيكلون</td><td>#SH30071</td><td>3.5٪ (0.1٪ لتحريض النسب)</td></tr> <tr><td>L-Glutamine &nbsp ؛</td><td>ThermoFisher</td> <td># 25030</td><td>التركيز النهائي 2 ملي مولار</td></tr><tr><td>الجلوتاثيون</td><td>ميرك</td> <td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو البشرة البشرية المؤتلف (EGF)</td> <td>Peprotech</td> <td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي المؤتلف (FGF)</td> <td>Peprotech</td> <td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>B27 مكمل</td><td>ThermoFisher</td> <td># 17504044</td><td></td></tr><tr><td>كارديوتروفين 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td> <td># 250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG ، سويسرا</td> <td># 100-125</td><td></td></tr> محلول <tr><td>الملح المتوازن هانكس (HBSS) CaCl2 (-) ، MgCl2 (-)</td> <td>ThermoFisher</td> <td># 14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05٪ Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td> <td># 25300</td><td></td></tr><tr><td>T75 قارورة</td><td>Sarstedt</td> <td># 83.3911</td><td></td></tr><tr><td> التمايز البطاني&nbsp; &nbsp; < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> وسط <tr><td>نمو الخلايا البطانية (EGM) -2 BulletKit</td><td>Lonza</td> <td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12K (Kaighn's) ThermoFisher</td><td></td> <td>المتوسط # 21127</td><td></td></tr><tr><td>Laminin &nbsp ؛</td><td>Merck</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#F4759</td><td>تمييع في ddH2O</td></tr><tr><td>6 Well Plate</td><td>Falcon</td> <td># 353046</td><td></td></tr><tr><td>محلول الفورمالديهايد</td><td></td> <td>Merck #F1635</td><td>ديلويت 1:10 في PBS (تركيز نهائي 3.7٪) Triton</td></tr> <tr><td>X-100</td><td>Merck</td> <td># 93420</td><td>0.1٪ في ddH2O</td></tr><tr><td>مصل الماعز العادي (10٪)</td> <td>ThermoFisher</td> <td>#50062Z</td><td></td></tr><tr><td>الجسم المضاد لعامل فون ويلبراند</td><td>Abcam</td><td>#ab6994</td><td>1:100 في مصل الماعز 10٪</td></tr><tr><td>مضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher</td> <td>#A11010</td><td>1: 500 في مصل الماعز بنسبة 10٪</td></tr><tr><td>4 '، 6-diamidino-2-phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)</td> <td>ThermoFisher</td> <td># 62247</td><td>1: 500 in ddH2O &nbsp ؛</td></tr><tr><td>طقم SlowFade Antifade</td><td>ThermoFisher</td> <td>#S2828</td><td></td></tr><tr><td>BX63 مجهر واسع</td> المجال <td>أوليمبوس</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > تشكيل أنبوب < / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>96 بئر لوحة</td><td>فالكون</td> <td># 353072</td><td></td></tr><tr><td>5 مل أنبوب سفلي دائري مع غطاء مصفاة</td><td>فالكون</td> <td># 352235</td><td></td></tr> عامل <tr><td>نمو Matrigel مخفض</td><td>Corning</td> <td># 354230</td><td></td></tr><tr><td>IX50 مجهر واسع</td><td>المجال أوليمبوس</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > Sca-1 + / CD31- عزل السكان الجانبي القلبي 34 &nbsp ؛ < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > كواشف < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pentobarbital Natrium 50 مجم / مل ad usum vet.</td><td>صيدلية المستشفى</td> <td>المنزلية # 9077862</td><td>حل العمل: 200 مجم / كجم</td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) CaCl2 (-) ، MgCl2 (-)</td> <td>ThermoFisher</td> <td># 20012</td><td></td></tr><tr><td>محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) CaCl2 (-) ، MgCl2 (-) ، الفينول الأحمر (-)</td> <td>ThermoFisher</td> <td># 14175</td><td>تحضير HBSS 500 مل + 2٪ FBS &nbsp ؛ لإخماد نشاط الكولاجيناز B &nbsp ؛</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1 جم / لتر من D-Glucose و L-Glutamine و Pyruvate</td><td>ThermoFisher</td> <td># 331885</td><td>Prepare DMEM + 10٪ FBS & nbsp ؛ + 25 ملي مولار هيبس + ف / ث ل Hoechst تثبيت</td></tr><tr><td>البنسلين - الستربتومايسين &nbsp ؛ (ملاحظة / ق)</td><td>ThermoFisher</td> <td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ThermoFisher</td> <td># 15630080</td><td>التركيز النهائي 25 ملي مصل</td></tr><tr><td>بقري الجنين (FBS)</td> <td>Hyclone</td> <td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>RBC LysisBuffer (10X) BioLegend</td><td></td> <td># 420301 / 100 مل</td><td>تمييع إلى 1X في ddH2O وتصفية من خلال 0.2 & micro ؛ مرشح م</td></tr><tr><td>كولاجيناز ب</td><td>ميرك</td> <td># 11088807001</td><td>التركيز النهائي 1 مجم / مل في HBSS ، يتم ترشيحه من خلال 0.2 & micro ؛ م مرشح</td></tr><tr><td>bisBenzimide H33342 ثلاثي هيدروكلوريد (Hoechst)</td> <td>Merck</td><td>#B2261</td><td>تحضير 1 مجم / مل في ddH2O</td></tr><tr><td>فيراباميل هيدروكلوريد &nbsp ؛</td><td>ميرك</td><td>#V4629</td><td>التركيز النهائي 83.3 & micro; M&nbsp;</td></tr><tr><td>APC الفئران المضادة للفأر CD31</td><td>BD Biosciences</td> <td># 551262</td><td>0.25 & micro ؛ g / 107cells</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A / E (Sca-1) BD</td> <td>Biosciences</td> <td># 557405</td><td>0.6 & micro ؛ ز / 10 < سوب>7 < / سوب> خلايا</td></tr><tr><td>7-أمينواكتينومايسين د (7-إضافة)</td> <td>ثيرموفيشر</td> <td>#A1310</td><td>0.15 ومايكرو ؛ g / 106cells</td></tr><tr><td>APC الفئران IgG2a k التحكم في النمط المتماثل</td><td>BD Biosciences</td> <td># 553932</td><td>0.25 & micro ؛ g / 107cells</td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a k التحكم في النمط المتشاوي</td><td>BD Biosciences</td> <td># 554688</td><td>0.6 & micro ؛ g / 107cells</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Needles 27G</td><td>Terumo</td><td>#NN-2719R</td><td></td></tr><tr><td>إبر 18G</td><td>Terumo</td><td>#NN-1838S</td><td></td></tr><tr><td>محاقن تستخدم مرة واحدة 1 مل</td><td>كودان</td> معقم <td># 62.1640</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette 3.5 مل</td><td>Sarstedt</td> <td># 86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>خلية مصفاة 40 وميكرو ؛ م الأزرق</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td># 352340</td><td></td></tr><tr><td>مصفاة الخلية 100 & micro ؛ م أصفر</td><td>BD Biosciences</td> <td># 352360</td><td></td></tr><tr><td>طبق Lumox 50</td><td>Sarstedt</td> <td># 94.6077.305</td><td></td></tr><tr><td>أطباق الثقافة P100</td><td>Corning</td> <td># أطباق الثقافة 353003</td><td></td></tr><tr><td>P60</td><td>Corning</td> <td># 353004</td><td></td></tr> <tr><td> mouse </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td> Line </td> <td> العمر </td><td><قوي>تربية< / قوي></td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6NRj / ذكر</td><td>12 أسبوعا</td><td>في المنزل</td><td></td></tr><tr><td><قوي>اسم المنتج</td><td>الشركة</td><td> الكتالوج رقم </td><td></td></tr><tr><td>Recodes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Dulbecco Medium (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td> <td># 12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / خليط المغذيات F12 Ham</td><td></td> <td>Merck #D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin &nbsp ؛ (ملاحظة / ق)</td><td>ThermoFisher</td> <td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني (FBS)</td> <td>هيكلون</td> <td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine &nbsp ؛</td><td>ThermoFisher</td> <td># 25030</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Merck</td> <td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>مكمل B27</td><td>ThermoFisher</td> <td># 17504044</td><td></td></tr> عامل <tr><td>نمو البشرة البشرية المؤتلف (EGF) Peprotech</td><td></td> <td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية المؤتلفة (FGF) Peprotech</td><td></td> <td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotrophin 1 & nbsp ؛</td><td>Peprotech</td> <td># 250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG ، سويسرا &nbsp ؛</td><td># 100-125</td><td></td></tr><tr><td>وسط نمو الخلايا البطانية (EGM) -2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>نظرة عامة على التراكيب المتوسطة. بعض هذه المعلومات متطابقة مع تلك الواردة أعلاه ، ولكن تم فرزها وفقا لتكوين الوسائط 1-3. < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > اسم المنتج < / قوي ></td> <td>< قوي >متوسط 1 < سوب > 8 < / قوي ></td> <td>< قوي >متوسط 2 < / قوي ></td> <td>< قوي > متوسط 3 < / قوي <></td></tr><tr><td>> كواشف < قوي ></td> <td><قوي> ثقافة < / قوي ></td> <td><قوي > تحريض النسب < / قوي ></td> <td>< قوي>البطانة diff.</td></tr> <tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35</td><td>٪</td> <td>35٪</td><td></td></tr> <tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / خليط المغذيات F12 لحم الخنزير</td><td>65٪ 65٪</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>البنسلين - الستربتومايسين &nbsp ؛ (ملاحظة / ق)</td><td>1٪</td> <td>1٪</td><td></td></tr> <tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS)</td> <td>3.5٪</td> <td>& le; 0.1٪</td><td></td></tr> <tr><td>L-Glutamine &nbsp ؛</td><td>2 ملي</td><td>مولار 2 ملي</td><td></td></tr><tr><td>جلوتاثيون</td><td>0.2 نانومتر</td><td>0.2 نانومتر</td><td></td></tr><tr><td>مكمل B27</td><td>1.3٪</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>عامل نمو البشرة البشرية المؤتلف (EGF)</td> <td>6.5 نانوغرام / مل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية المؤتلفة (FGF)</td> <td>13 نانوغرام / مل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>كارديوتروفين 1 & nbsp ؛</td><td>0.65 نانوغرام / مل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ثرومبين</td><td>0.0005 وحدة / مل</td><td></td><td>جميع المكونات الضرورية المدرجة في المجموعة</td></tr><tr><td>وسط نمو الخلايا البطانية (EGM) -2 BulletKit</td><td></td><td></td><td>جميع المكونات الضرورية المدرجة في المجموعة</td></tr></tbody></table>

تحريض غشائي التمايز في خلايا القلب السلف تحت ظروف المصل منخفضة

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

قد تكون الخلايا السلف القلب (Cpc) الإمكانات العلاجية لتجديد القلب بعد الإصابة. في قلب الثدييات الكبار، Cpc الجوهرية شحيحة للغاية، ولكن تكلفة النقرة موسعة يمكن أن تكون مفيدة للعلاج بالخلايا. شرطا مسبقاً لاستخدامها هو قدرتها على التفريق بطريقة الخاضعة للرقابة في الأنساب القلب المختلفة باستخدام بروتوكولات محددة وتتسم بالكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، عند التوسع في المختبر ، Cpc المعزولة من المرضى أو نماذج المرض الإكلينيكية قد توفر أدوات البحث المثمر لتحقيق آليات المرض.
الدراسات الحالية استخدام علامات مختلفة لتحديد تكلفة النقرة. ومع ذلك، ليس كل منهم يعبر عن البشر، مما يحد من تأثير متعدية الجنسيات من بعض الدراسات الإكلينيكية. سوف تسمح البروتوكولات التمايز قابلة للتطبيق بغض النظر عن التعبير عزلة تقنية وعلامة لتوسيع موحدة وفتيلة Cpc لغرض العلاج خلية. هنا يصف لنا أن فتيلة من تكلفة النقرة تحت تركيز مصل بقرى الجنين منخفضة (FBS) وخلية منخفض الكثافة ظروف تسهل غشائي التفريق بين استخدام اثنين من الفئات السكانية الفرعية المختلفة من الماوس وفار Cpc-Cpc، نظهر أن laminin أكثر الركيزة مناسبة من فيبرونيكتين لهذا الغرض بموجب البروتوكول التالي: بعد استزراع عن 2-3 أيام في المتوسط بما في ذلك المكملات الغذائية أن الحفاظ على مولتيبوتينسي ومع 3.5% FBS، Cpc هي تبذر في لامينين في < التقاء 60% ومثقف في المتوسط خالية من الملحق بتركيزات منخفضة من FBS (0.1 ٪) لمدة 20-24 ساعة قبل التمايز في متوسطة التمايز بطانية. نظراً لتكلفة النقرة عدد سكان غير متجانسة، تركيزات مصل الدم ومرات الحضانة قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لخصائص يتدنى التصنيف الخاصة بكل منها. ونظرا لهذا، يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من تكلفة النقرة، فضلا عن التقنية ويوفر وسيلة مفيدة للتحقيق في إمكانية وآليات للتمايز وكيف أنها تتأثر بالمرض عند استخدام Cpc معزولة عن نماذج المرض كل منهما.

عزل SP-الحزب الشيوعي الصيني الماوس:
في هذه الدراسة، قمنا باستخدام الماوس Cpc المعزولة وفقا النمط الظاهري SP، بينما يتم تعديل النتائج من الفئران Cpc وأضيف من تقرير سابق مع الإذن (الشكل 8)33.
تكاثر الخلايا تحت خلية عالية ومنخفضة الكثافة ومع تركيزات مصل الدم المختلفة:
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

ويصف هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لخلايا القلب السلف. لا سيما وهو يركز على كيف تؤثر على إمكانيات التمايز غشائي تركيز المصل وكثافة البذر الخلية.

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

إن التمييز بين خلايا السلف القلبي، أو الممارسات الكيميائية، عند التضخيم يتطلب التحول من مرحلة الانتشار إلى مرحلة ملتزمة، ويستخدم هذا البروتوكول نسباً بطانةياً فعالاً في الممارسات الكيميائية. ومن المزايا الرئيسية لهذه التقنية أنها تنطبق على الـ CPCs المعزولة بناء على عدة تقنيات ومن أنواع مختلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتعزيز الإمكانات العلاجية لـ CPCs للعلاج الخلوي.ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة إمكانات وآليات التمايز وكيفية تأثر هذه الأمراض بمرض القلب. CPCs هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا التي قد تختلف في الشكل والحجم، والفعالية. ولذلك، يجب تعديل البروتوكول وفقاً للاكتظاظ الفرعي المحدد لـ CPCs المستخدم.بعد تخدير الماوس، مسح أسفل صدره مع الإيثانول 70٪. باستخدام مقص، وقطع الجلد وجدار الصدر لفضح تجويف الصدر. استخدام ملقط لرفع القلب، ومن ثم استخدام مقص لقطع عليه في القاعدة.نقل القلب إلى طبق ثقافة P60 تحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة، ومن ثم استخدام ملقط لضخ القلب وإخراج الدم من التجاويف. ضع القلب في طبق P60 يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS البارد واغسله. استخدام مقص صغير لإزالة الأذين، وقطع القلب إلى قطعتين طولية، وغسلها في خمسة ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني.باستخدام مقص صغير، وقطع قطع القلب إلى أقسام أصغر. أضف قطرة من محلول الملح المتوازن من هانك الذي يحتوي على الكولاجيناز B بتركيز واحد ملليغرام لكل ملليلتر، واستخدم شفرة حلاقة معقمة لتمرم قطع القلب الصغيرة بدقة. بعد ذلك، أضف 2.5 ملليلتر من محلول الكولاجيناز B إلى الطبق.ضع الطبق بزاوية 30 درجة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. دع قطع القلب المفروم تحتضن لمدة أقصاها 30 دقيقة أثناء تمريرها مرارًا وتكرارًا من خلال ماصة باستور كل 10 دقائق أثناء الحضانة. أولا، إضافة خمسة ملليلتر من HBSS الباردة تكملها 2٪ FBS لقطع القلب المفروم ومتجانسة.باستخدام مرشح 100 ميكرومتر، تصفية قطع القلب لإزالة أي أنسجة غير مهضومة. جهاز طرد مركزي في 470 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة.احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق مع اهتزاز في بعض الأحيان. بعد ذلك، إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وتصفية العينة من خلال مرشح 40 ميكرومتر لاستبعاد الخلايا الأكبر بما في ذلك خلايا القلب المتبقية. جهاز طرد مركزي في 470 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق دون كسر.ثم، إعادة تعليق الخلايا في DMEM تكملها مع 10٪ FBS، تهدف إلى تركيز الخلية النهائية من مليون خلية لكل ملليلتر. توزيع الخلايا في أنبوبين لتلطيخ وفرز، مضيفا 1.5 ملليلتر من حل الخلية إلى أنبوب واحد و 3.5 ملليلتر إلى الأنبوب الثاني. إضافة حل Hoechst واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع التقليب في بعض الأحيان لضمان توزيع متساو للصبغة ومنع تخثر الخلايا.يظهر الالسّكان جانبيّة في ال أدنىّ هويشّت ركن يسرى جانبا من الالسّكان رئيسيّة. في مؤامرة FACS يمكن تحديدها على أساس السيطرة السلبية التي فيراباميل يدفع السكان الجانب إلى تختفي. الاحماء المتوسطة واحد إلى 37 درجة مئوية وتبرد جهاز الطرد المركزي إلى أربع درجات مئوية.أجهزة الطرد المركزي أنابيب الفرز في 470 مرة G و4 درجات مئوية لمدة ست دقائق. ثم، إعادة تعليق الخلايا في واحد المتوسطة. نقل الخلايا إلى طبق P60 الغاز نفاذية تحتوي على أربعة ملليلتر من واحد متوسطة.تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام حتى الخلايا قد وصلت إلى التقاء بين 70 و 80٪ الثقافة SP-CPCs لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في قارورة T75 باستخدام ثمانية ملليلترات من واحد متوسطة في كل قارورة. المقبل، بعناية الطامح المتوسطة وشطف بلطف قارورة مع خمسة ملليلتر من HBSS دافئة. علاج الخلايا مع خمسة ملليلتر من التربسين EDTA لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.ثم، إضافة خمسة ملليلتر من واحد متوسطة لوقف نشاط التربسين، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 470 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعادة تعليق الخلايا في متوسطة واحدة أو اثنين متوسطة.لوحة الخلايا على أطباق P60، والطلاء 250، 000 SP-CPCs في الطبق مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط تحتوي على تركيزات مصل مختلفة. بعد يومين من الاستزراع، اجمع المتوسط من كل طبق إلى أنبوب 15 ملليلتر لجمع الخلايا الميتة. تبسينيزي الخلايا الملتصية كما سبق وصفها وجمع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر الذي يحتوي على المتوسطة التي تم جمعها.جهاز طرد مركزي في 840 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم pirate عظمى وإضافة ملليلتر واحد إما متوسطة واحدة أو متوسطة اثنين لعد الخلايا. وصمة عار SP-CPCs مع الأزرق trypan عد الخلايا القابلة للحياة والميتة. أولاً، استلهم الوسط من الخلايا المعدة، وشطفها بلطف بخمسة ملليلترات من HBSS الدافئة.علاج الخلايا مع خمسة ملليلتر من التربسين EDTA لمدة خمس دقائق في حاضنة الخلية. ثم، إضافة خمسة ملليلتر من واحد متوسطة لوقف نشاط التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 470 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.استلهمت من فوق ونضيف متوسطتين لعد الخلايا. بعد ذلك ، بذور 80000 خلية في كل بئر من لوحة ثقافة ستة جيدا المغلفة مسبقا مع ثلاثة ملليلتر من اثنين المتوسطة. الحفاظ على لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة، ومن ثم تغيير المتوسطة في كل بئر إلى ثلاثة ملليلتر من ثلاثة متوسطة.ثقافة لوحة لمدة 21 يوما، وتغيير الوسط كل ثلاثة أيام. بعد ذلك، وصمة عار الخلايا مع علامة البطانية وإجراء المجهر الفلورية للتحقق من طبيعة البطانية من الخلايا المتمايزة. أولاً، pirate المتوسطة من الخلايا المعدة وشطفها بلطف مع خمسة ملليلتر من HBSS الحارة.علاج الخلايا مع مليلتر اثنين من تريبسين EDTA لمدة خمس دقائق في حاضنة الخلية، ثم إضافة ثلاثة ملليلترات من ثلاثة المتوسطة لوقف نشاط التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 470 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. التعرق و إضافة ملليلتر واحد من ثلاثة متوسطة، pipetting بلطف لخلط.عد الخلايا والبذور بين 2،000 و 4،000 الخلايا في 100 ميكروليتر من ثلاثة المتوسطة لكل مصفوفة المغلفة جيدا من لوحة 96-جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، استخدم مجهرًا مشرقًا في التكبير مرتين لالتقاط صورة للخلايا.في هذه الدراسة، يتم استكشاف ظروف مناسبة لتسهيل التزام النسب البطاني للخلايا السلف القلبية. عندما يكون التقاء الخلية عند أو أقل من 60٪ لا يظهر فرق كبير في العينات المعالجة بنسبة 3.5٪FBS. عندما يتم التعامل مع الخلايا في هذا الالتقاء مع 0.1٪ FBS, أنها تظهر انخفاضا في انتشار الخلايا على اللامينيين بالمقارنة مع فيبرومينكتين, ولكن تظهر أي زيادة في موت الخلايا.وعلى النقيض من ذلك، لا تظهر الخلايا في التقاء عال أي فرق كبير في انتشار الخلايا أو موت الخلايا بين الشرطين. ويبدو أن التغيرات في شكل الخلية مؤشر على ظروف مناسبة لثقافة التمايز البطانية التي ستكون ناجحة فيها. في غضون سبعة إلى 14 يوما في وسط التمايز البطانية، وينظر إلى الثقافات الناجحة على أنها تحتوي على خلايا أكبر مع مورفولوجيا مختلفة.ومن المثير للاهتمام أن هذه الخلايا اختفت في نهاية مرحلة التمايز وتميل إلى الظهور بأعداد أقل وفي وقت لاحق في الثقافات ذات الكثافة العالية. تكوين أنبوب هو ناجح باستمرار في الخلايا مطلية في كثافة منخفضة وتفاضلية على اللامينين، في حين أنه ينظر إلى أن تفشل في الغالب في الخلايا مطلية في كثافة عالية. في حين أن تكوين الأنبوب غير ناجح في الغالب في الخلايا المستزرعة على الليفية بغض النظر عن كثافة الخلايا ، فإن تلك التي تتمايز في كثافة منخفضة تشكل في بعض الأحيان أنابيب بدائية.إن تركيز المصل وكثافة الخلايا للحث على النسب البطاني أمران حاسمان، ويجب تعديلهما لضمان إبطاء الانتشار مع الحفاظ على الاستمرارية. عند تحريض النسب، يمكن استخدام CPCs من البشر أو نماذج الأمراض قبل الإكلينيكية لدراسات زرع الخلايا لتقييم إمكاناتها في التمايز الجسم الحي. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في دراسة أو إنشاء أدوات تجديد قلب جديدة ، وكان يستخدم سابقًا لدراسة الآلية الجزيئية لالتزام النسب المبكر.

induction-endothelial-differentiation-cardiac-progenitor-cells-under

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

أقمنا على بروتوكول لتحريض مباشر من cardioblasts المحفزة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في ظل ظروف محددة المحافظة مع الجزيئات الصغيرة ، والتي تمكن من اشتقاق كميات كبيرة من أسلاف الإنسان والقلب العضلية وظيفية لإصلاح القلب والأوعية الدموية.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

الدراسة الحالية يصف نهجا موجها التمايز في حفز البنكرياس من تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. أهمية كبيرة هو أن العثور على نضوج الخلايا البطانية يتوسط شارك في ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المستمدة الأسلاف البنكرياس الى خلايا الانسولين تعبير.

البطانية نضوج خلية يتوسط المشارك ثقافة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين في نهج التفاضل إخراج

يصف هذا البروتوكول التحريض الفعال للبطانة المنشأ وأسلاف المكونة للدم متعددة الإمكانات من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عبر التعبير القسري لعوامل النسخ.

الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية

تصف هذه المخطوطة إنشاء أنسجة قلبية هندسية محددة باستخدام تعبير علامات السطح وفرز الخلايا. يمكن بعد ذلك استخدام الأنسجة المحددة في مفاعل حيوي متعدد الأنسجة للتحقيق في آليات العلاج بخلايا القلب من أجل توفير نظام نموذجي وظيفي ، ولكن خاضع للرقابة ، لقلب الإنسان.

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) تشارك بشكل حاسم في اتساع الأوعية الدموية في الأنسجة الدماغية. يصف هذا الأسلوب عزلة EPCS الإنسان من الدم المحيطي، وكذلك التعرف على إمكانات المهاجرة ضد عينات مصل الدم من المرضى لعمليات جراحية في القلب.

عزل الخلايا البطانية السلف من المتطوعين الأصحاء وإمكاناتهم الكثيرة تأثر عينات المصل بعد جراحة القلب

والهدف من هذا البروتوكول عزل السلف غشائي الخلايا من دم الحبل السري. وتشمل بعض التطبيقات باستخدام هذه الخلايا كالعلامات البيولوجية لتحديد المرضى مع مخاطر القلب والأوعية الدموية، علاج الأمراض الدماغية، وخلق صمام الأوعية الدموية والقلب هندسة الأنسجة بنيات.

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

هنا يمكننا وصف أسلوب لتحجيم، استخدام تركيبة بسيطة أضافت أ ووساطة lentivirus Id1-أوفيريكسبريشن، لتوليد أول قلب مثل حقل المتكفل القلب و cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية.

الجيل الأول قلب مثل حقل المتكفل القلب و Cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

الغرض من هذه الطريقة هو توليد القلب حقل محدد خلايا القلب السلف في المختبر من أجل دراسة مواصفات الخلية السلف والخصائص الوظيفية، وتوليد خلايا القلب غرفة محددة لنمذجة أمراض القلب.

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

يولد هذا البروتوكول أنسجة قلبية هندسية على شكل شبكة تحتوي على خلايا القلب والأوعية الدموية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان للسماح بالتحري عن علاج زرع الخلايا لأمراض القلب.

إعداد الأنسجة القلبية المهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا iPS البشرية لإصلاح عضلة القلب في فيفو

يعرض هنا بروتوكول بسيط للتمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حوالي 1 أسبوع.

التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

اكتشف بروتوكولاً فعالاً لتحريض التمايز البطاني في خلايا القلب السلف CPCs باستخدام مصل منخفض وكثافة خلايا منخفضة على ركائز اللامينين. تدعم هذه الطريقة دراسات التجدد القلبي وتطبيقات العلاج الخلوي.

تحريض غشائي التمايز في خلايا القلب السلف تحت ظروف المصل منخفضة

استكشف المزيد من الفيديوهات