عكس التحليل التضخيم متحاور حلقة تتوسط النسخ (RT-مصباح) للفيروس Zika والجينات التدبير المنزلي في البول والمصل، وعينات البعوض

ويمكن لهذه الطريقة أن تحدد بسرعة ما إذا كانت العينات تحتوي على فيروس زيكا. وهذا مفيد للحوامل، أو الأزواج الذين يحاولون الحمل، أو مراقبة مجموعات البعوض المحلية المعرضة لخطر الإصابة بعدوى زيكا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وسهلة ، ولا تتطلب معدات باهظة الثمن ، ويمكن القيام به دون خطوة عزل RNA.

تمتد آثار هذه التقنية نحو تشخيص عدوى زيكا، لأن العدوى أثناء الحمل مرتبطة بالإجهاض، والإملاص، وغيرها من العيوب الخلقية العصبية الخلقية الحادة. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على زيكا، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على الأمراض المعدية الأخرى مثل حمى الضنك أو الشيكونغونيا أو فيروس غرب النيل باستخدام الأساليب التمهيدية الخاصة بالفيروس. للبدء، إعادة تشكيل كل التمهيدي RT-LAMP في المياه الصف الجزيئي إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومولار.

دوامة بإيجاز التمهيدي الحل لضمان الحل متجانسة. جهاز طرد مركزي لمدة خمس ثوانٍ بسرعة قصوى لجمع الحل التمهيدي. ثم إعداد مزيج التمهيدي RT-LAMP 10x كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول التكنولوجيا.

دوامة لفترة وجيزة لضمان التجانس. وطاردة مركزية لفترة وجيزة في أقصى سرعة لتجنب أي خسارة. تخزين التمهيديات في ناقص 20 درجة مئوية، بين الاستخدامات، وتجنب أي دورات التجميد ذوبان.

بالنسبة لعينات البول البشري، استخدم البول الطازج أو البول المجمد أو البول في مادة حافظة. ذوبان أي عينات مجمدة على الجليد قبل استخدامها. وينبغي أن تكون عينات مصل الإنسان إما جديدة أو مجمدة، في حين أن خطوط الخلايا المصابة ZIKV يجب أن تحتوي على وسائل الإعلام مكيفة أو lysates الخلية.

وأخيرا ، بالنسبة لـ Aedes aegypti البعوض ، واستخدام الذبائح كلها ، إما الطازجة أو المجمدة. ذوبان أي جثث البعوض المجمدة على الجليد. وضع البعوض الفردية في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.

باستخدام طرف P10 ماصة سحق البعوض 10 مرات، والتجانس عليه لخلق البعوض الخام lysate. لفترة وجيزة الطرد المركزي الخام ل بيليه أي حطام واستخدام فائق لتحليل المحطة الهابعية RT-LAMP. للبدء ، وإعداد رد فعل المزيج RT-LAMP الرئيسي على الجليد لكل مجموعة التمهيدي لاستخدامها ، كما هو مخطط من الجدول الثالث في بروتوكول التكنولوجيا.

دوامة كل عينة لضمان أنها مختلطة بشكل جيد. ثم تدور لفترة وجيزة لهم إلى أسفل لمنع فقدان حجم. لكل رد فعل، ماصة 23.0 ميكرولترات من مزيج ماجستير RT-LAMP في أنبوب PCR 200 ميكرولتر.

ثم، إضافة اثنين microliters من العينة لتحقيق حجم الكلية إلى 25.0 ميكرولترات. استخدام المياه الصف الجزيئي للسيطرة السلبية، وتأكد من أن تشمل سيطرة إيجابية. اختياريا، وتشمل رد فعل مراقبة خصوصية من فيروس arbo ذات الصلة مثل فيروس حمى الضنك، كما هو مبين في بروتوكول التكنولوجيا.

باستخدام كتلة الحرارة، حمام الماء، أو الحرارية، تسخين العينات في 61 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بزيادة الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتسخين البوليميراز. إجراء تحليل RT-LAMP في مساحة مغلقة منفصلة.

تمييع صبغ حمض الحمض النووي الفلوري من واحد إلى عشرة في عازلة TAE. أضف اثنين من micorliters من محلول صبغ حمض النوى الفلورية إلى 12 micorliters من رد فعل RT-LAMP. تقييم ردود فعل RT-LAMP بصريا من خلال البحث عن وجود تغيير اللون.

استخدم اختياريًا كاميرا لالتقاط صور لتفاعلات RT-LAMP على خلفية بيضاء. بعد ذلك، ضع العينات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 302 نانومتر لتأكيد وجود منتجات RT-LAMP بواسطة الفلورسينس. استخدم كاميرا لالتقاط صورة للنتيجة.

لبدء تنفيذ electrophoresis صب 2٪ agarose هلام في 1x TAE العازلة مع وصمة عار حمض نووي للتصور. إضافة خمسة ميكروليترات من سلم الحمض النووي في الممر الأول لمقارنة الأوزان الجزيئية. لكل رد فعل RT-LAMP، اخلط 13 ميكرولترات من خليط تفاعل RT-LAMP مع اثنين من ميكرولترات من صبغة تحميل الحمض النووي.

تحميل هذا الخليط 15 ميكرولتر. تشغيل الجل في 90 فولت لمدة 90 دقيقة أو حتى يتم فصل العصابات. صورة مع 302 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية.

عند الانتهاء، تخلص من تفاعلات RT-LAMP في أكياس مختومة مزدوجة. في هذه الدراسة، يتم استخدام ثلاث طرق مختلفة لتحليل ردود فعل RT-LAMP. عند استخدام الحمض النووي الفلوري صبغ ردود الفعل الإيجابية تصبح صفراء وخضراء في اللون، في حين تظهر ردود الفعل السلبية البرتقالي.

هذه الصبغة أيضا النتائج في إشارة الفلورسنت عندما تكون العينات متحمسون من الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة. وأخيرا، يمكن أن تنفد ردود فعل RT-LAMP على هلام agarose. ردود فعل إيجابية RT-LAMP سيكون لها نمط النطاقات، في حين أن ردود الفعل السلبية لن يكون لها عصابات الحمض النووي.

وتستخدم هذه الأساليب لشرح خصوصية رد فعل ZIKV RT-LAMP. فقط للضوابط الجزيئية ZIKV لديه رد فعل RT-LAMP إيجابية. وعلاوة على ذلك، في حين يتم الكشف عن ZIKV في كل من البول والمصل للمريض مع عدوى ZIKV المعروفة، فإنه لا ينظر في المريض مراقبة الأعراض دون عدوى ZIKV.

ثم يتم اختبار العينات لrRNA 18S الإنسان. فقط العينات التي أخذت من المرضى تعتبر إيجابية ل 18S rRNA. ويمكن اختبار عينات البعوض بشكل مماثل لـ ZIKV أو مراقبة جودة الـ RT-LAMP AEDAE.

فقط المكافحة الجزيئية الإيجابية لـ ZIKV والبعوض المصابة بـ ZIKV تعتبر إيجابية لـ ZIKV. ومع ذلك جميع البعوض إيجابية لAEDAE بواسطة RT-LAMP. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في أقل من 30 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

من المهم أن نتذكر أن ردود فعل RT-LAMP عرضة لردود فعل إيجابية كاذبة. وتشمل خطوات الوقاية استخدام جليكوسيل الحمض النووي thermolabile في ردود الفعل، وذلك باستخدام سير العمل الجانبي، وإجراء التحليل في مكان منفصل، والحد من الوقت بعد أنابيب التضخيم مفتوحة. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل QPCR للإجابة على أسئلة إضافية، مثل عدد النسخ الفيروس، أو أهداف أخرى، موجودة في العينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام RT-LAMP للكشف عن فيروس زيكا والضوابط المستهدفة في البول والمصل البشري، وكذلك البعوض. لا تنس أن العمل مع فيروس زيكا ووصمة حمض النووي يمكن أن تكون خطرة للغاية، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات دائمًا أثناء إجراء هذا الإجراء. وبالنظر إلى ارتباط عدوى فيروس زيكا بتشوهات خلقية، ينبغي للنساء الحوامل أو اللواتي يحاولن الحمل أو شركاء هؤلاء النساء، أن يقللن إلى أدنى حد من تعرضهن مختبرياً لفيروس زيكا.