تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية، مثل تحديد أحداث إعادة التركيب المتجانسة في الخلايا الجذعية الجنينية للماوس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها دقيقة وموثوقة، وتستخدم على نطاق واسع. لذا، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتحديد أحداث إعادة التركيب المتجانسة في الخلايا الجذعية الجنينية للماوس.

ويمكن أيضا أن تطبق على نظم أخرى، مثل الخلايا المعدلة وراثيا أو الحيوانات. بشكل عام، سوف تناضل الفردية الجديدة لهذا الأسلوب لأنه يستغرق وقتاً طويلاً وينطوي على خطوات متعددة. لكل gDNA، مزيج 30 ميكرولترات من 10 × العازلة لDRA واحد، وثلاثة ميكرولترات من DRA واحد و 10 ميكروغرام من gDNAs لكل عينة.

يضاف الماء حتى الحجم النهائي هو 30 ميكرولترات، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لهضم gDNAs. إعداد 1٪ agarose جل الكهرباء مع بروميد الإثيديوم. قم بتحميل العينات التي تم الحصول عليها سابقًا مع سلم كيلوبايت واحد على الجل ، وتشغيله بسرعة 30 إلى 40 فولت بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي، نقع الجل في علبة تحتوي على محلول حمض الهيدروكلوريك 0.2 نيوتن. استخدم الشاكر لتهز الصينية بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل الجل إلى علبة تحتوي على محلول الحمض النووي.

اهزها بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم نقل الجل في علبة تحتوي على حل تحييد الحمض النووي. وتهزها بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام نظام نقل تنازلي سريع، نقل DNAs من الجل إلى الغشاء. المقبل، وتجميع النشاف turble وكومة النشاف كما هو مبين في التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. بعد ذلك، أخرج الغشاء واغسله بـ 2 من سترات الصوديوم المالحة X لمدة دقيقة واحدة.

امتصاص السائل مع الأنسجة، ومن ثم استخدام crosslinker الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط الحمض النووي مع الغشاء. للبدء في وضع العلامات على مسابير الحمض النووي مع النشاط الإشعاعي، إضافة الحرارة denatured مسابير DNAs إلى الأنبوب الذي يحتوي على استعداد للذهاب الحمض النووي وضع العلامات الخرز. الماصة صعودا وهبوطا لخلط.

وإضافة خمسة ميكروليترات من deoxycytodine المسمى مشعا ثلاثي الفوسفات. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تنقية مسابير المسمى باستخدام G 50 أعمدة صغيرة وفقا للتعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.

استخدم عداد التألق لقياس النشاط الإشعاعي. للبدء في تهجين الأغشية باستخدام المسابير المسماة، ضع الغشاء في أنبوب التهجين. إضافة حل ما قبل التهجين المختلط.

ضع الأنبوب في فرن التهجين واترك التهجين قبل ذلك 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، إزالة الأنبوب من الفرن وصب محلول ما قبل التهجين في أنبوب 50 ملليلتر. إضافة التحقيق التشويه، ومزيج بلطف.

لإزالة المسابير غير المهجّنة، ضع الغشاء في صينية تحتوي على سترات صوديوم ملحية X مع 0.1٪SDS واهزها بلطف عند 55 إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بلف الغشاء بلف بلاستيكي ثم قم بإصلاحه في الكاسيت المتعرض. في غرفة مظلمة، يعرض الغشاء إلى ورقتين من فيلم الأشعة السينية.

تطوير الفيلم لتصور النتائج. تحديد ما إذا كان استنساخ ES المقابلة هو واحد المطلوب مع هدف إعادة التركيب أم لا، وفقا لأحجام العصابات الحمض النووي التي اكتشفتها المسابير. في هذه الدراسة، يتم استخدام النشاف الجنوبي و PCR لتحديد أحداث الموارد البشرية التي تحدث في خلايا ماوس ES لتوليد نموذجين الماوس استبدال الجينية NM باستخدام خلايا ES تستند HR بوساطة تكنولوجيا الاستهداف.

لأن يتم قطع DNAs الجينوم إلى أجزاء كثيرة بأطوال مختلفة، فإنها تعرض مسحة مثل حالة على هلام الحمض النووي. وهذا يشير إلى هضم كامل من DNAs الجينومية. كخطوة أخيرة من النشاف الجنوبي، يتم عرض إشارات من النشاط الإشعاعي مسمّى مسبار التهجين مع جزء الحمض النووي الهدف على الفيلم.

ويعكس ظهور النطاقات المتوقعة حدوث أحداث الموارد البشرية في استنساخ ES. وفقا ل predesign في الدراسة ، وES استنساخ مع أليل تحور لها اثنين من حجم نطاقات متميزة. في حين أن الحيوانات المستنسخة من النوع البري ES لديها نطاق واحد فقط ، مما يشير إلى أن المستنسخات ES المطلوبة هي heterozygous.

بعد تفاعل PCR، يمكن تحليل منتجات PCR على هلام الحمض النووي. إذا لوحظ نطاق محدد من حجم NPCR، وهذا يشير إلى حدوث الأحداث الموارد البشرية التي يمكن تأكيدها كذلك عن طريق تسلسل هذا النطاق PCR. امتدت الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج لتحديد طفرة النقطة لأن الأساس مطابق.

أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن يكون المريض والحذر. بعد هذا الإجراء، طريقة أخرى مثل الحقن المجهري من الخلية ES في blastocysts يمكن أن يتم تنفيذها من أجل الإجابة على سؤال إضافي مثل تشكيل الحيوانات الشميرية. Aft تطورها، ومهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجالها البيولوجيا الجزيئية والخلوية لاستكشاف وظيفة جين معين أو نتيجة جين متحول في الفئران أو خارجها.

لا ننسى أن العمل مع صمّة النشاط الإشعاعي P32 DCTB يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي أن تكون الاحتياطات مثل التدريع مع مجلس الحماية دائماً اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.