نموذج ماوس سينجينيك اللمفاوية ب-خلية للتقييم قبل الإكلينيكية لخلايا تي سيارة CD19
أكتوبر 16, 2018
وهنا، يقدم بروتوكول لإنتاج واختبار قبل الإكلينيكية مورين CD19 سيارة تي الخلايا عن طريق توصيل الفيروسات التراجعية واستخدامها كعلاج ضد المنشأة سينجينيك A20 ب-خلية سرطان الغدد الليمفاوية في الفئران بالب/c مع أو بدون ليمفوديبليتينج تكييف مسبقاً.
هذه الطريقة يمكن أن تساعدنا على الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج المناعي في CAR T-cell، مثل التعديل الجيني للخلايا التائية CAR والاقتران مع العلاجات المناعية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التي تسمح بالمقارنة بين الزخرف اللمفاوي وإعدادات المنضب اللمفاوية. وهذا يسمح لنا أن نرى دور الخلايا المناعية الذاتية في كل من تطور المرض وتفاعلها مع العلاجية CAR T cells.The الآثار المترتبة على هذه التقنية كما 10 للعلاج على تشخيص الورم الصلب لأن الدروس المستفادة في هذا النموذج يمكن ترجمتها مباشرة إلى منزل الحلوى مع أهداف أخرى مثل CEA. لبدء هذا الإجراء. أولاً، إعداد كافة الوسائط والخلايا المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول النص. في اليوم الأول في DMEM كاملة إلى 15 أطباق ثقافة سنتيمتر مربع. بذور 7.5 مليون البلاتين الخلايا الإلكترونية في هذه الأطباق واحتضان بين عشية وضحاها في 37
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لإنتاج خلايا CAR T من نوع CD19 الفأرية عن طريق ترنسدكشن فيروسي ارتجاعي. وتستكشف تطبيقها كعلاج ضد سرطان ليمفوما الخلايا البائية A20 متماثلة الجينات والمستقرة في فئران BALB/c، مع أو بدون تهيئة مسبقة لاستنزاف الخلايا اللمفاوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- العلاج المناعي
- علم الأورام
- البيولوجيا الخلوية
خلفية علمية
- يُعد العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR T-cell therapy) نهجاً واعداً في علاج السرطان.
- من الضروري فهم التفاعل بين الخلايا التائية CAR T-cells والخلايا المناعية الداخلية.
- تركز الدراسة على المقارنة بين الحالات ذات المستويات الطبيعية من الخلايا اللمفاوية (lympho-replete) والحالات التي خضعت لاستنزاف الخلايا اللمفاوية (lympho-depleted).
- قد تكون الرؤى المكتسبة قابلة للتطبيق على الأورام الصلبة والأهداف العلاجية الأخرى.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لإنتاج خلايا CD19 CAR T.
- تقييم فعالية هذه الخلايا في علاج الليمفوما.
- استقصاء دور البيئة المناعية في نتائج العلاج.
الطرق المستخدمة
- تحضير الأوساط والخلايا وفقاً للبروتوكول الموضح.
- استزراع خلايا E-Cells البلاتينية في أطباق المزرعة.
- حضن الخلايا تحت ظروف مضبوطة.
- تقييم وظائف خلايا CAR T-cell في بيئات مناعية مختلفة.
النتائج الرئيسية
- الإنتاج الناجح لخلايا CAR T الموجهة ضد CD19 الفأرية.
- إثبات وجود اختلافات في الفعالية العلاجية بناءً على التهيئة المناعية.
- رؤى حول دور الخلايا المناعية الداخلية في الاستجابة للعلاج.
- الآثار المحتملة لتطبيقات أوسع في مجال علم الأورام.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لأبحاث خلايا CAR T.
- تساهم النتائج في فهم تفاعلات خلايا CAR T داخل الجسم الحي.
- قد تتوسع الدراسات المستقبلية بناءً على هذه النتائج لتحسين علاجات السرطان.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول التقييم قبل السريري لخلايا CAR T الموجهة ضد CD19 في نموذج فأر مصاب بليمفوما متجانس جينياً، مما يدعم التحقق من الهدف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مسارات تطوير العلاج المناعي للأورام. ومن خلال المقارنة بين حالات الوفرة اللمفاوية والاستنزاف اللمفاوي، يوفر هذا البروتوكول ثقة تنبؤية في فعالية خلايا CAR T والتفاعلات مع البيئة المجهرية المناعية. كما يدعم هذا النموذج قرارات الاكتشاف المبكرة لبنى خلايا CAR T والعلاجات المركبة قبل إجراء الدراسات التمكينية لتقديم طلبات الأدوية الجديدة قيد البحث (IND).
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استجواب بنيات خلايا CAR T ضد ليمفوما الخلايا البائية المستقرة للتحقق من الارتباط بالهدف وخصوصية المستضد.
- القيمة التشغيلية: توفر نظاماً قابلاً للتكرار لتقييم وظائف خلايا CAR T خارج الجسم الحي باستخدام قياس التدفق الخلوي، والقياس اللومينومتري، ومقايسة ELISA.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد خلايا CAR T فئرانية موثقة لغرض الفحص اللاحق للتعديلات الجينية والتسليح بالسيتوكينات (على سبيل المثال IL-12).
- القيمة التشغيلية: توحيد سير عمل إنتاج الفيروسات القهقرية ونقل الجينات باستخدام خلايا Plat-E، وبنى MP71، والطرد المركزي بمساعدة الفيبرونيكتين.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: اختبار نشاط خلايا CAR T في الجسم الحي عبر التصوير بالتلألؤ البيولوجي وتتبع تطور المرض في نماذج الليمفوما الجهازية.
- القيمة التشغيلية: تمكين المقارنة بين حالات الإشباع اللمفاوي والاستنزاف اللمفاوي لتقليل مخاطر الآليات العلاجية وتوجيه استراتيجيات العلاج المشترك.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، حيث تدعم تحديد التصاميم الواعدة لخلايا CAR T-cell وتوفر البيانات اللازمة للتحقق قبل السريري من خلال نمذجة السياق المناعي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات عمل خلايا CAR T والتفاعلات مع الخلايا المناعية الداخلية في الليمفوما.
- الفحص: توفر منتجات CAR T خلوية قياسية وقابلة للقياس لضمان ظروف مقايسة قابلة للتكرار.
- التحليلات: تستخدم التألق الحيوي، وقياس التدفق الخلوي، ومقايسة ELISA لإنتاج قراءات مقارنة بين المجموعات التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تضع نماذج للأهمية المرضية في مضيفات متماثلة جينياً لسد الفجوة بين مرحلة الاكتشاف وتقييم الفعالية قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم إصدارات CAR T، وتوليفات السيتوكينات، والعلاجات المساعدة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف ورؤية ميكانيكية في ديناميكيات خلايا CAR T والبيئة الدقيقة المناعية.
- القيمة التشغيلية: إنتاج خلايا CAR T قابل للتكرار والتحقق الوظيفي عبر قراءات خارج الجسم (ex vivo) وفي الجسم الحي (in vivo).
- القيمة الاستراتيجية: توجيه قرارات الاستمرار أو التوقف من خلال الكشف عن الفعالية المعتمدة على استنفاد الخلايا اللمفاوية وإمكانات العلاج المشترك.
- تأثير المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمرشحي خلايا CAR T بناءً على الاستجابة للسياق المناعي.
اعتبارات التنفيذ
- خبرة في إنتاج الناقلات الفيروسية القهقرية، وزراعة الخلايا، والمقايسات المناعية.
- الوصول إلى خلايا E-Cells البلاتينية، وقطع الفبرونيكتين المؤشبة، وبنية تحتية للمستوى الثاني من السلامة البيولوجية.
- توحيد كفاءة ترصيص الجينات والتحقق من تعبير مستقبلات CAR عبر الدفعات المختلفة.
- اعتبارات التكييف لمختلف تراكيب CAR، والمستضدات المستهدفة، ونماذج اللمفوما الفأرية.
- تشمل القيود العملية تعبير المستضد الخاص بالنموذج والاختلافات في الجهاز المناعي للفئران مقابل الفسيولوجيا البشرية.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
0:55
Days 1 & 2: Preparation and Transfection of Plat-E Retroviral Packaging Cell Line
2:11
Day 3: Preparation of Virus-Containing Supernatant for Transduction and Isolation and In Vitro Activation of Mouse Splenic T Cells
4:27
Day 4: Transduction of Mouse T Cells
6:43
Day 5: Round 2 of Transduction
8:33
In Vitro Validation of CAR T Cell Activity
9:53
Results: Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells
11:32
Conclusion
