نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية تأثير المواد الحيوية على قابلية الإصابة بالعدوى، وكيف تؤثر على تطور مثل هذه العدوى، وكيف تؤثر على سلوك الخلايا المناعية حول مثل هذه المواد الحيوية في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر نموذجًا حيوانيًا جديدًا يسمح بالتصور الحي والتحليل داخل الرحم للعدوى المرتبطة بالمواد الحيوية. إن البرهان المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأن حقن ميكروفرات المواد الحيوية هو إجراء دقيق للغاية.

لتوليد تعليق البكتيريا فقط، نقل أول أربع إلى خمس مستعمرات من سلالة الفلورسنت ستايف أوريوس mCherry، المستزرعة على لوحات زراعة الصويا تريبوتي تكملها 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول إلى 10 ملليلتر من مرق الصويا التربتيك تستكمل مع الكلورامفينيكول، للنمو في مرحلة النمو في منتصف لوغاريتمي في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. عندما تصل الثقافة إلى قياس الكثافة البصرية في 620 نانومتر من 0.4 إلى 0.8 ، وجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي ، وغسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة في غسل. بعد الغسيل الثاني، resuspend بيليه في 1.1 ملليلتر من PVP، ودوامة التعليق البكتيري قبل قياس الكثافة البصرية مرة أخرى.

ثم ضبط تركيز التعليق البكتيري مع PVP وفقا للمتطلبات التجريبية لتوليد تعليق البكتيريا فقط. لتوليد البكتيريا microsphere تعليق، أجهزة الطرد المركزي التجارية البوليسترين microspheres، PS-10، وإعادة معادلة بيليه microsphere في تعليق البكتيريا فقط. تمييع تعليق البكتيريا microsphere مع حجم 1/2 من PVP للوصول إلى تركيز مناسب من البكتيريا في التعليق الذي هو تقريبا 2/3 من ذلك في تعليق البكتيريا فقط.

اخلطي التعليق عن طريق الدوامة. للتحقق من تركيز البكتيريا فقط والبكتيريا microsphere تعليق، إضافة 100 ميكرولترات من كل تعليق إلى الآبار الفردية من لوحة 96 جيدا. تخفيف تسلسليا 10 ميكرولتر aliquots من التعليقات في 90 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيم في الآبار اللاحقة، وذلك باستخدام نصائح جديدة لكل خطوة التخفيف.

تطبيق 10 ميكرولتر 10 اسكوت عن التعليقات البكتيرية غير المخففة والمخففة على لوحات أجار، واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، عد المستعمرات لحساب عدد البكتيريا داخل البكتيريا الجاهزة فقط والبكتيريا microsphere تعليق. بعد جمع أجنة سمك الحمار الوحشي، والتخلص من أي أجنة غير شفافة غير قابلة للحياة، واحتضان ما يقرب من 60 جنينا لكل 100 ملليلتر طبق بيتري في 28 درجة مئوية في المتوسط E3 الطازجة.

بعد التخدير، اعزل الأجنة الإيجابية من GFP للمجهر الفلوري. نقلها إلى طبق بيتري 100 ملليلتر من E3 المتوسطة. لإنشاء قالب حقن، وملء طبق بيتري 100 ملليلتر مع واحد إلى 1.5٪ من الأزهرة السائلة.

استخدام قالب قالب من البلاستيك لإنشاء الأخاغ في agarose. عندما عززت agarose، وإزالة القالب، وتغطية أجار مع E3 المتوسطة تكمل مع 0.02٪ tricaine. يوم واحد ثلاثة بعد الإخصاب، واستخدام ملقط لكسر غيض من إبرة الزجاج microcapillary سحب لتحقيق نصائح مع ما يقرب من 20 ميكرومتر القطر الخارجي تحت مجهر خفيف مع شريط مقياس في العين.

تعديل فتح طرف الإبرة هو عملي لحقن microspheres. يجب تعديل قطر الفتحة للميكروسفيرات الدقيقة من مختلف الأحجام. ثم استخدام طرف ماصة Microloader لتحميل الإبرة مع ما يقرب من 20 ميكرولتردات من البكتيريا microsphere أو تعليق البكتيريا فقط، وجبل الإبرة على micromanipulator متصلة مجهرية.

الآن نقل الأجنة المختارة إلى لوحة أغاروز مخدد. بعد انتظار خمس دقائق حتى يتم تخدير الأجنة، محاذاة الأجنة داخل الأخادق في اتجاه واحد لحقنها. تعيين الحقن المجهري إلى إعدادات الحقن المناسبة، وإدراج الإبرة في الأنسجة العضلية للجنين الأول في زاوية 45 إلى 60 درجة تحت مجهر ستيريو.

نقل بلطف الإبرة ذهابا وإيابا لضبط الموقف داخل الأنسجة حسب الضرورة، واستخدام دواسة القدم microinjector لحقن تعليق محملة. عند حقن البكتيريا microsphere تعليق في أنسجة أجنة حمار وحشي، يجب إدخال الإبرة بلطف ولكن مع اليد ثابتة. بعد الإدراج الناجح، يجب إنشاء مساحة للمواد قبل الحقن.

عندما يتم حقن جميع الأجنة ، يسجل الأجنة لحقن ناجح تحت مجهر الفلورانس الاستريو ، والحفاظ على الأجنة في E3 المتوسطة دون tricaine في آبار فردية من 48 بئرًا مع تغييرات متوسطة يوميًا. لرصد تطور العدوى عن طريق تكوين وحدة كمية مستعمرة، نقل عشوائيا خمسة إلى ستة الأجنة المصابة قابلة للحياة في الأنابيب الدقيقة الفردية ملليلتر بعد وقت قصير من الحقن، وغسل بلطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني عقيم. بعد التخلص من يغسل، إضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني معقم إلى كل أنبوب، تليها اثنين إلى ثلاثة حبات الزركونيا قطرها ملليمترين معقمة.

ثم سحق الأجنة في التجانس في 3، 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية، والثقافة متجانسة كما هو موضح. ضع طبق بيتري 100 ملليمتر يحتوي على E3 متوسطة مكمّلة بنسبة 0.02٪ tricaine على مرحلة مجهر الفلورانس ستيريو ، وأضف 500 ميكرولترات من 2٪ ميثيلسيلولوزي في طبق بيتري. لرصد تقدم العدوى عن طريق المجهر الفلوريس، وتجهيز المناسبة مشرق الحقل والمرشحات الفلورية، محاذاة الأجنة المصابة تخدير أفقيا في بقعة من ميثيلسيللوز في طبق بيتري.

استخدم فلتر الحقل الساطع لجعل الأنسجة التالفة المحقونة موضع التركيز عند التكبير 160x. تعيين عمق Z-المكدس في 10 ميكرومتر وحجم الخطوة في خمسة ميكرومتر للسماح بتسجيل ثلاث صور متتالية. ثم صورة الأجنة الفردية تحت إعدادات محسنة متطابقة في التكبير 160x.

استخدم البرنامج المساعد ObjectJ في ImageJ لتحليل الصور. الحقن العضلي من ستاف aureus يبدأ عدوى تعتمد على الجرعة في الأجنة، مع تطور العدوى القابلة للتطبيق لوحظ في الأجنة تدار جرعات عالية التحدي في اليومين الأول والثاني بعد الحقن. كما هو موضح، فمن الممكن لحقن أعداد مماثلة من البكتيريا في وجود أو عدم وجود microspheres.

عادة، جميع الأجنة مع أكثر من 20 وحدات تشكيل مستعمرة من ستاف aureus mCherry إيجابية لفلورانس تحت التهديف المجهرية، على الرغم من وجود microspheres يبدو أن لا تؤثر بشكل كبير على تطور العدوى في الأجنة طعن جرعة منخفضة. في الأجنة المطعون فيها عالية الدوس، لا يظهر التسجيل المجهري أي اختلافات في تردد الأجنة المصابة مع أو بدون مجهر، ولكن الثقافة الكمية تكشف عن أرقام وحدات تكوين مستعمرة أعلى يتم استردادها من الأجنة في مجموعة ستاف أوريوس بالإضافة إلى مجموعة الغلاف الدقيق مقارنة بتلك التي يتم حصادها من مجموعة ستاف أوريوس فقط في يومين بعد الحقن. وجود المواد الحيوية يؤثر على كل من استجابة الخلية المناعية والتعرض الأولي للعدوى.

على سبيل المثال، في خمس ساعات بعد الحقن، فإن تسلل الضامة استجابة لحقن Staph aureus فقط أعلى بكثير مما كان عليه استجابة لحقن المكورات العنقودية بالإضافة إلى الميكروس، بينما في يوم واحد بعد الحقن، تظهر الأجنة ذات الميكروسفيرات مستويات أعلى بكثير من عدوى اوريوس ستايف من الأجنة بدون مجهرية. من المهم أن نتذكر دائما لضبط فتح طرف إبرة لحجم المواد الحيوية وضبط نسبة تركيز البكتيريا في تعليق البكتيريا فقط والبكتيريا microsphere تعليق. هذا نموذج الجنين حمار وحشي يسمح في تصور في الجسم الحي وتحليل داخل مدينة تطور العدوى وردود الخلايا المناعية أثار في وجود وغياب المواد الحيوية.

توفر هذه التقنية نموذجًا جديدًا لكل الحيوان لتطوير المواد الحيوية المضادة للميكروبات واستراتيجيات العلاج للأجهزة الطبية الآمنة.