إنشاء وتحليل لشريحة الورم Explants كشرط مسبق للاختبار التشخيصي
نوفمبر 29, 2018
نحن نقدم طريقة لتوليد وزراعة والتحليل المنهجي لشرائح أورجانوتيبيك المستمدة من أورام الرئة موريني. ونحن أيضا وصف كيفية تحسين لسمك الشريحة، وكيفية تحديد تركيزات العقاقير لعلاج الورم شرائح.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البحوث قبل الإكلينيكية ، حيث قد تخدم دراسات الاستجابة للأدوية في الخلايا الجرّة للورم أغراضًا تشخيصية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يمكن لشريحة explants نافذة قصيرة من الزمن نموذج البيولوجيا المعقدة للأنسجة الأصلية بما في ذلك وظائف موزعة مكانيا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في استخدام شرائح من أورام الرئة مورين، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنواع الأنسجة الأخرى بما في ذلك الأنسجة البشرية.
للبدء، وإعداد هزاز وتنفيذ VibraCheck وفقا للتعليمات الواردة في الدليل. ثم ملء كل بئر من لوحة 24-جيدا مع ملليلتر واحد من حل الملح المتوازن هانك تكملها البنسلين وstreptomycin والحفاظ على لوحة على الجليد. إدراج الإبر 25 قياس في جميع الكفوف الأربعة من الماوس القتل الرحيم وضعت على غطاء الستايروفوم بحيث يتعرض الصدر وتمدد الحيوان.
رش 70٪ الكحول على سطح الجلد المكشوف. استخدم المقص الموضوع في موضع الزاوية لقطع الجلد من البطن نحو الصدر وإلى منطقة الرقبة. تمدد الجلد على كلا الجانبين باستخدام ملقط وأدخل إبر قياس 25.
قطع فتح منطقة البطن. ثم قطع فتح القفص الصدري والحجاب الحاجز لفضح الرئة والقلب. كشف القصبة الهوائية عن طريق قطع بعيدا الأنسجة المحيطة بها.
تشريح الرئتين، جنبا إلى جنب مع القلب. ضع الأنسجة في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 30 ملليلتر من الجليد البارد HBSS مكمّل مع Pen-Strep وضع على الجليد والمضي قدما إلى الخطوة التالية في أسرع وقت ممكن. الآن نقل الرئتين الحاملة للورم إلى لوحة زراعة الأنسجة 10 سنتيمترات.
استخدام مقص معقمة والملقط لفصل فصوص الرئة وتحديد فصوص مع الأورام على السطح لشرائح. ضع فص الرئة مع نسيج الورم على قطعة من ورقة التصفية لتجنب الانزلاق وقطع جزء من الرئة العادية أو نسيج الورم إضافية التي تحيط بالورم باستخدام مشرط عقيم لتوليد سطح قطعة الأنسجة المسطحة. تراجع الجانب المسطح في قطرة من مادة السيانواكريلات لاصقة وجبله على حامل العينة هزاز بحيث يواجه الورم شفرة في وضع مستقيم، والسماح لها الجافة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
ضع حامل العينة الاهتزازية في علبة العازلة المعدنية. املأ الصينية بـ HBSS الباردة المكملة بالقلم العقدي حتى تغمر الأنسجة في المخزن المؤقت. غطي صينية العازلة بغطاء Plexiglas الذي يتم توفيره مع الأداة ووضع الدرج في حمام جليدي أبيض وإضافة الثلج للحفاظ على برودة الأنسجة أثناء التقطيع.
إرفاق حمام الجليد الأبيض إلى هزاز. ثم حدد إعدادات التقطيع المناسبة وابدأ في التقطيع. جلب شفرة هزاز إلى موقف تشريح وتعيين نافذة تشريح.
استخدام ملقط العقيمة لجمع شرائح في لوحة 24-well مليئة بميليلتر واحد من HBSS تكملها القلم-سترب في بئر والحفاظ على الجليد. مع الحفاظ على تتبع من أجل تشريح، علامة كل بئر من لوحة 24-جيدا وفقا للخطة التجريبية. جمع شريحة الأنسجة المجاورة لشرائح مثقف كساعة صفر أو مرجع غير مثقف.
جمع ما لا يقل عن ثلاث شرائح مرجعية لتمثيل أعلى، مركز وأسفل الأنسجة. وبمجرد الانتهاء من تشريح، والاستمرار في تحديد وتجهيز. بعد ذلك، إعداد لوحة ستة بئر تحتوي على 2.5 ملليلتر من الثقافة المتوسطة في البئر عن طريق وضع شبكات التيتانيوم في ذلك.
تأكد من عدم تشكيل فقاعات الهواء بين شبكة التيتانيوم والمتوسطة. لتحميل شريحة على الشبكة الحفاظ على لوحة ستة جيدا في وضع الزاوية بحيث يغطي جزء من المتوسطة الشبكة. ثم ضع الشريحة في الوسط على الشبكة واستخدم ملقط لنشرها.
بعد وضع الشرائح، قم بتحميل لوحات الآبار الستة على وحدة الحضانة الدورية الموضوعة داخل حاضنة مرطبة يتم صيانتها عند 37 درجة مئوية مع 95٪ 02 و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بدء دورة التناوب. للزراعة على المدى الطويل تجديد المتوسطة الثقافة كل يوم باستخدام ملقط العقيمة لرفع الشبكة التي تحتوي على شرائح الأنسجة ووضعها في بئر فارغة من لوحة ستة جيدا.
استبدال 70٪ من المتوسطة مع ثقافة جديدة المتوسطة ووضع الشبكة مرة أخرى في. متابعة دورة التدوير كما كان سابقاً. لعلاج المخدرات على شرائح الورم إضافة 2.5 ملليلتر من وسائل الإعلام مع المخدرات المخفف أو السيطرة على السيارة في لوحة ستة جيدا.
ضع شبكات التيتانيوم في الآبار ثم ضع الشرائح على الشبكات كما كان عليه في السابق. بعد إجراء العلاجات لمدة 24 ساعة، استمر في التثبيت والمعالجة. لبدء تحديد الشريحة المطلوبة نقل بعناية باستخدام ملقط في لوحة 10 سنتيمترات تحتوي على ورقة مرشح غارقة مليئة برنامج تلفزيوني ملليلتر 2-3 والسماح لها تطفو.
ثم ارفع ورق التصفية مع زوج من ملقط وضعه في كاسيت هستو. نقل ورقة عامل التصفية إلى كاسيت هستو. إضافة قطرة من الهماوكسيلين المخفف على رأس شريحة الأنسجة للاحتفال موقف شريحة للخطوات اللاحقة.
أغلق الكاسيت، ثم قم بنقله إلى 4٪ حل buffered buffered 4٪ وترك بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد غسل ومعالجة الكاسيت كما هو موضح في البروتوكول، افتح كاسيت الهستو واستخدم مشرطًا لرفع الشريحة الثابتة بعناية من ورق التصفية. تجاهل ورقة التصفية ونقل شريحة إلى قالب يحتوي على البارافين السائل.
استخدام الوزن المسطح للضغط على الأنسجة ضد الجزء السفلي من القالب تضمين لضمان حتى قسم. ضع الجزء السفلي من كاسيت histo على رأس القالب. إضافة البارافين السائل على أعلى منه.
ودع القالب يبرد على طبق بارد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك فصل العفن المبرد من كتلة البارافين. استخدام microtome لإعداد أربعة ميكرومتر أجزاء رقيقة من كتل شريحة الأنسجة FFPE.
تقليم بعيدا عن فائض من البارافين المحيطة الأنسجة. للحصول على أقسام حتى في جميع أنحاء الأنسجة ضبط زاوية كتلة بحيث سطح كتلة هو اتجاه أفقيا فيما يتعلق شفرة. باستخدام فرشاة رقيقة جمع أقسام الأنسجة المتتابعة من شريحة الأنسجة البارافين جزءا من بدءا من الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية.
مواصلة جمع أقسام من طبقات الأنسجة أعمق إلى الوسط، تليها الجزء السفلي من الشرائح الزجاجية. يتم تجميع المقاطع من طبقات مختلفة من كل شريحة نسيج إلى شرائح الكائن لتمكين التقاط التدرجات التي تسببها الثقافة المحتملة في قابلية البقاء أو ترحيل الخلايا أو التعبير العلامات الحيوية. بعد جمع الأقسام مواصلة تجهيزها ومزيد من التحليل على النحو المبين في البروتوكول.
يمكن أن يؤثر سمك شريحة الأنسجة على صلاحية الشرائح المستزرعة. في هذه الحالة، تظهر شرائح سميكة 250 ميكرومتر زيادة التدرجات النخر بالمقارنة مع شرائح سميكة 200 ميكرومتر بسبب شرائح أكثر سمكا تصبح عرضة لنقص في الأكسجين أو نشر المغذيات عبر الشرائح. ومع ذلك، تحتوي شرائح رقيقة 160 ميكرومتر على مناطق نخرية كبيرة ربما يكون سببها المعالجة التقنية أثناء تحديد المواقع من الشرائح لأن هذه هي هشة وتميل إلى حليقة.
تحليل NKX2-1، علامة على سرطان الرئة المتمايزة جيدا، ويبين أن التعبير لا يتغير بشكل كبير في شرائح مثقف بالمقارنة مع شرائح صفر ساعة غير ثرثرة. كما أكد التحليل الكمي للتعبير NKX2-1 أن التعبير لم يتغير بشكل كبير في الشرائح المستزرعة مقابل الشرائح غير المُزَوَّجة، مما يشير إلى أن عملية الزراعة لا تؤثر بشكل واضح على حالة التمايز في أنسجة الغدة السرطانية. لاختبار ما إذا كان يمكن استخدام شرائح أنسجة الورم لتقييم فعالية الأدوية المستهدفة ، تم علاجها مع DMSO أو كميات من المركبات.
عندما تعامل مع dactolisib واحد من الميكرومولار الذي يستهدف مسالك mTOR تم تثبيط 4EBP1. 0.5 سيلوميتينيب ميكرومولار الذي يستهدف مسار كيناز MAP كان فعالاً في تثبيط فسفور ERK1/2. بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية العمل مع وتحليل شرائح قطع طازجة من أنسجة الورم الثمينة.
ساهم لدينا ما بعد الدكتوراه السابقة، كاتيا ناري، بشكل كبير في تأسيس هذه الطريقة بالتعاون مع الزملاء في منصة شريحة الأنسجة IMI Predect Consortium.
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة طريقة لإنشاء وتحليل شرائح عضوية من أورام رئة الفئران. توضح المقالة تحسين سمك الشريحة واختيار تركيز الدواء للعلاج الفعال.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- البحث قبل السريري
الخلفية
- يمكن أن تحاكي الشرائح العضوية الوظائف البيولوجية المعقدة للأنسجة الطبيعية.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على أنواع مختلفة من الأنسجة، بما في ذلك الأنسجة البشرية.
- يمكن أن تساعد دراسات استجابة الدواء في شرائح الأورام في التشخيص.
- تعمل أورام رئة الفئران كنموذج لدراسة بيولوجيا الأورام.
هدف الدراسة
- لتطوير نهج منظم لتحليل شرائح أورام الرئة.
- لتحسين ظروف العلاج بالعقاقير في شرائح الأورام.
- لتوفير بروتوكول يمكن تكييفه مع أنواع مختلفة من الأنسجة.
الطرق المستخدمة
- إعداد الڤيبراتوم وألواح زراعة الأنسجة.
- تشريح وقطع أنسجة الرئة الحاملة للورم.
- زراعة الشرائح في حاضنة مرطبة.
- العلاج بالعقاقير والتثبيت اللاحق للشرائح للتحليل.
النتائج الرئيسية
- نجح إنشاء شرائح عضوية من أورام رئة الفئران.
- تم تحسين سمك الشريحة وتركيزات الدواء.
- تتيح الطريقة دراسة استجابات الدواء في بيئة مضبوطة.
- يمكن تطبيق الرؤى المكتسبة على أنواع أخرى من الأنسجة.
الاستنتاجات
- تعزز الطريقة المطورة فهم بيولوجيا الأورام.
- توفر أداة قيمة لاختبار الأدوية قبل السريرية.
- يمكن أن توسع الدراسات المستقبلية هذه النهج إلى الأنسجة البشرية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Tumor slice explants preserve native tissue architecture and intratumor heterogeneity, enabling physiologically relevant preclinical models for diagnostic and drug response studies. This approach supports target validation by maintaining spatially resolved signaling and stromal interactions critical for mechanistic de-risking. Systematic analysis of heterogeneous markers prior to treatment ensures predictive confidence in downstream translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by preserving spatially distributed oncogenic functions such as signaling activities and stromal infiltration.
- Operational Value: Enables functional target validation through analysis of marker expression heterogeneity in adjacent slices as a prerequisite for drug studies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by maintaining differentiation status (e.g., NKX2-1 expression) during short-term culture, reducing false-positive target assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable outputs for downstream compound evaluation.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and cultivation on rotating incubation units to improve viability and reproducibility across experiments.
- Scalability: Facilitates platform reuse through optimization of slice thickness (e.g., 200-micrometer) to minimize necrosis gradients and technical artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by enabling evaluation of drug-induced marker alterations in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Assesses pathway-specific drug effects (e.g., mTOR via 4EBP1 phosphorylation, MAPK via ERK1/2 inhibition) in intact tissue contexts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by capturing culture-induced gradients in viability, migration, or biomarker expression via layered section analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification by providing quantitative, spatially resolved biomarker data essential for hypothesis testing and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by preserving native tissue architecture and multicellular interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice thickness optimization and daily medium replenishment on rotating incubation units.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via sequential section collection to capture viability and expression gradients across tissue layers.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by analyzing drug-treated slices for alterations in differentiation and pathway markers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for systematic analysis of heterogeneous tissue markers as a prerequisite across tumor types and drug classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through preservation of intratumor heterogeneity and stable marker expression during short-term culture.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via rotating incubation units and optimized slice thickness (200-micrometer) to reduce necrosis and handling artifacts.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of targeted drug efficacy (e.g., dactolisib, selumetinib) on pathway phosphorylation in physiologically relevant models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via systematic analysis of adjacent slices as zero-hour references to distinguish cultivation effects from drug responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vibratome-based tissue slicing and histological processing for sequential section analysis.
- Dependent on instrumentation including rotating incubation units, microtomes, and embedding systems for FFPE sectioning.
- Necessitates cross-team standardization of slice thickness optimization and reference slice collection (top, center, bottom) to account for heterogeneity.
- Involves adaptation considerations across model systems, as thin slices (160-micrometer) may curl during handling while thick slices (250-micrometer) risk diffusion-limited necrosis.
- Practical limitation: Slice thickness must be empirically optimized per tissue type to balance viability, structural integrity, and oxygen/nutrient diffusion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Collection of Tumor-bearing Lungs
2:08
Generation and Cultivation of Precision-cut Lung Tumor Slices, and Treatment with Inhibitors
5:58
Fixation and Processing of the Tissue Slices
7:27
Processing and Analysis of Formalin-fixed and Paraffin-embedded (FFPE) Tissues
8:33
Results: Assessment of Viability, Specific Marker Expression, and Targeted Drug Treatment on Adenocarcinoma Tissue Slices
10:26
Conclusion
