تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة

يساعد بروتوكولنا العلماء على تحليل شبكة أكتوميوسين دون الخلايا في الخلايا الظهارية الفردية ويسمح لهم أيضًا بإجراء تحليل مماثل على نطاق متعدد الخلايا في الأنسجة الظهارية المنحنية. بروتوكولنا هو مثال لطيف على تطبيق فيجي. لديها واجهة مستخدم رسومية بديهية ، ولا تتطلب أي معرفة بالبرمجة النصية.

ولذلك ، فهي مناسبة للغاية أيضا للمستخدمين المبتدئين في هذا المجال. على الرغم من أن طريقتنا وضعت لغرف البيض Drosophila، فإنه ينطبق أيضا خارج دروبيليا دروسفيلا. ونحن نشجع العلماء على اختبار بروتوكولنا في نظمهم النموذجية.

استخدم ملفات الاختبار المصاحبة للتعرف على هذا البروتوكول. وسوف تساعدك على تحديد أي جزء من هذا البروتوكول هو مناسبة لسؤال البحوث الفردية الخاصة بك. يسمح هذا الجزء من البروتوكول للمستخدمين بتجزئة الخلايا الظهارية في أفلام الفاصل الزمني وتحليل نبضات أكتوميوسين في الخلايا الفردية بمرور الوقت باستخدام مدير Surface Manager.

لبدء، افتح فيجي، واستيراد ماكرو الأنسجة الخلايا الخلاياالمفمول. ijm كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. ثم افتح ملف TIFF مصححة، وقم بتقسيم قنوات الملف المصحح بالتبييض عن طريق الانتقال إلى شريط القوائم، وتحديد صورة، متبوعة بالألوان، وتحديد قنوات الانقسام.

تشغيل البرنامج النصي الذي تم تحميله على قناة غشاء الخلية النشطة للفيلم الفاصل الزمني المحدد عن طريق الضغط على أيقونة تشغيل في البرنامج النصي المفتوح. من أجل الحصول على قناع خلية لطيفة، تعيين طمس Gaussian إلى 2.500 وحساسية الكشف عن الخلايا إلى ناقص واحد، وانقر فوق موافق. ثم تعيين التسامح الضوضاء المقدر بين 10 و 20 لأفلام الفاصل الزمني المكتسبة مع الهدف 63x، وانقر فوق موافق. يظهر قناع خلية تم إنشاؤه في فيلم الفاصل الزمني المحلل ، ويظهر إطار جديد يسمى ParticleStack ، ويظهر أيضًا إطار صغير يسمى Action Required. من قناع الخلية على الفيلم الفاصل الزمني، والتركيز فقط على الخلايا في الوسط، وحدد تلك التي يمكن أن توفر خطوط خارجية كاملة ومحددة جيدا في جميع أنحاء الفيلم الفاصل الزمني.

عندما تتوافق الخلايا المحددة في المركز بشكل جيد مع أغشية الخلايا الحقيقية ، احفظ ParticleStack كملف TIFF. افتح ملف ParticleStack TIFF المطابق في فيجي. مع تثبيت البرنامج المساعد Surface Manager في فيجي، افتح البرنامج المساعد.

في إدارة السطح، انقر فوق الزر قراءة صورة المخطط التفصيلي، وتعيين مؤشر جاككارد إلى 60٪ تحميل الخطوط العريضة قد يستغرق عدة دقائق اعتماداً على عدد الخلايا. بمجرد تحميل، سيتم تعيين رقم S لكل خلية وتظهر في الجزء الأيمن من نافذة Surface Manager. انقر فوق رقم S المحدد بحيث المخطط التفصيلي للخلية المستوردة من ParticleStack1.

تظهر tiff على الفيلم الفاصل الزمني. تحقق من كل رقم S مستورد للحصول على جودة المخطط التفصيلي للخلية خلال الفيلم، وإزالة الخلايا غير المرغوب فيها التي تعرض حدوداً خارجية غير صحيحة للخلية. لإزالة خلية غير مرغوب فيها، قم بتمييز مخطط الخلية وانقر على الزر حذف.

استخدم أداة فرشاة لتصحيح حدود الخلية. عند الانتهاء، احفظ الخلايا المصححة كـ RoiSet. ملف مضغوط.

لتحديد ما إذا كانت البقول أكتوميوسين موجودة في الأنسجة التي تم تحليلها وفهم السلوك التفصيلي ، وكذلك اتجاه إشارات أكتوميوسين ، تبدأ بفتح فيجي. فتح فيلم الفاصل الزمني، تحميل الجسيمات المحفوظة1. قناع خلية tiff والفيلم الفاصل الزمني المصحح بالتبييض، ثم قم بتحميل المكون الإضافي Surface Manager والمنطقة المقابلة ذات الاهتمام من RoiSet.

ملف مضغوط. بعد ذلك، في "مدير Surface"، قم بتنشيط قناة مع إشارات الاهتمام. انقر فوق الزر إحصائيات للحصول على إطار يسمى متوسط قيمة الرمادية شريحة حسب الشريحة.

سيتم عرض الشدات المتوسطة والوسيلية لإشارات أكتوميوسين بمرور الوقت في وحدات تعسفية، وكذلك معلمات أخرى تتعلق بمساحة الخلية وشكلها. حفظ القيم كملف جدول بيانات عن طريق الانتقال إلى إطار الإحصائيات، والنقر على ملف، وتحديد حفظ As.similarly، إنشاء قناع خلية، وتحميله في مدير السطح من أجل تحليل نبضات أكتوميوسين في مقياس الأنسجة. يسمح هذا الجزء من البروتوكول للمستخدمين باستخراج طبقة رقيقة من أكتوميوسين في الأنسجة الظهارية المنحنية بمرور الوقت.

هذه الخطوات سهلة الاستخدام وتستند إلى واجهة رسومية بديهية. افتح فيجي، وتأكد من تثبيت المكون الإضافي لإسقاط سطح الإهليلجي. ثم، فتح فيلم الفاصل الزمني، وتصديره كملف XML/HDF5 عن طريق النقر على الإضافات، والذهاب إلى BigDataViewer، وتحديد تصدير الصورة الحالية كملف XML/HDF5.

بعد ذلك ، افتح الملف المصدر في إسقاط سطح الإهليلجي من خلال الانتقال إلى الإضافات ، والنقر على BigDataViewer ، متبوعًا بإسقاط سطح الإهليلجي ، وتحديد ملف XML. هذا سيفتح نافذة جديدة مع وجهات النظر القوس من غرفة البيض، وسوف تظهر مربع حوار لتوجيه المستخدم من خلال معالجة. إطار الحوار، يسمى إسقاط المبيضين، يحتوي على علامات تبويب متعددة.

في علامة التبويب الحوار الأول، تسمى مربع المحيط، قم بتعريف حدود x و y لحجرة البيض في فيلم الفاصل الزمني مع عرض z للمربع المحيط، ثم اضغط على مجموعة. يتم تمييز الأجزاء المختارة من غرفة البيض باللون الوردي. بعد ذلك، حدد حجم النقط الإشارة في علامة التبويب الحوار تسمى البحث عن النقط في إطار الإسقاط المبيض.

تعريف سيجما وقيمة الذروة الحد الأدنى. ثم، اضغط على حساب لتحديد إشارات أكتوميوسين، والتي سوف تظهر على أنها النقط الخضراء. أعد محاولة هذه الخطوة مع معلمات مختلفة حتى يتم العثور على حوالي 100 البقع.

تحديد إشارات أكتوميوسين هو خطوة حاسمة. ذلك يعتمد على جودة الإشارة والحجم الصحيح من النقط المكتشفة. إذا لم تكن هناك بقع خضراء مرئية في الصورة، ثم الخطوة التالية لن تعمل.

لتصميم الإهليلجي، تابع مع علامة التبويب التي تسمى الإهليلجي المناسب. تعيين عينات عشوائية إلى 10،000، خارج / داخل قطع المسافة إلى واحد إلى 10، ثم انقر فوق حساب. بعد ذلك، سيتم فتح علامة التبويب تسمى الإسقاط تلقائياً ويسمح بتعريف استخراج السطح.

في علامة التبويب الإسقاط، قم بإعداد مسافة عرض الحد الأدنى والأقصى كعرض الإهليلجي المطلوب. يجب أن تتناسب مسافة الإسقاط الحد الأدنى والأقصى بحيث تتضمن منطقة الإهليلجية ذات التعريف الوردي الطبقة الخارجية بأكملها من غرفة البيض. ثم، حدد مسافة الشريحة كشريحة واحدة.

تأكد من أن المنطقة الوردية من الإهليلجي مع تعريف مع على غرفة البيض مرئية قبل الضغط على حساب. يساعد على تقييم جودة تناسب جديد من الإهليلجي. بعد ذلك، تعيين عرض إخراج من الإهليلجي إلى أكبر من أو يساوي 800 وارتفاع أكبر من أو يساوي 400.

ثم، تعيين مدة استخراج السطح، واختيار إما كروية أو إسقاط أسطواني. إذا لزم الأمر، قم بقلب Z ومحاذاة Y.Press لحساب للحصول على استخراج السطح لكلا القناتين في نوافذ جديدة تسمى الصورة. ضبط سطوع وعلى النقيض من النوافذ الصورة التي تم الحصول عليها لتكون قادرة على رؤية الإشارات actomyosin المتوقعة من خلال النقر على الصورة، والذهاب إلى ضبط، واختيار السطوع / التباين.

إذا كان استخراج السطح يبدو جيدًا، احفظ كلا القناتين بشكل منفصل كملفات TIFF. بالإضافة إلى ذلك، حفظ ملف نافذة السجل للرجوع إليها في المستقبل كيفية استخراج سطح هذه الغرفة البيض معينة. ثم دمج القنوات مع رمز اللون المفضل في فيجي وحفظ النتائج كملفات TIFF.

هذا البروتوكول يتيح للعلماء للتحقيق في سلوك شبكات أكتوميوسين في الأنسجة الظهارية. وهذا ممكن فقط عندما يتم الجمع بين تحليل مفصل للسلوك أكتوميوسين في النطاق الخلوي المحلي مع تحليل مماثل على نطاق الأنسجة. تظهر هنا أمثلة تمثيلية من السلوك الديناميكي myosin II على النطاق الخلوي المحلي وعلى مقياس الأنسجة للسيطرة و fat2 متحولة Drosophila البيض غرف.

على المستوى الواحد القاعدي، تنتقل سلسلة الضوء التنظيمي المعدلة الخضراء لإشارات الميوسين الثاني عمودية على المحور الأمامي الأمامي لحجرات البيض الخاضعة للتحكم. يتم فقدان هذه القطبية في غرف البيض متحولة fat2 ويؤدي إلى نبضات myosin II anisotropic، والتذبذبات على مستوى الأنسجة، والأخضر تعديل سلسلة الضوء التنظيمي من الميوسين الثاني في عينة التحكم يولد القوة المتزامنة اللازمة لتعزيز التناوب الظهارية. في المقابل، ظهارة المسام من غرفة البيض متحولة الدهون2 نبض بقوة في الجانب القاعدي ويفشل في توليد القوة المتزامنة اللازمة لتعزيز التناوب الظهارية.

في منطقة رقيقة من البيض Drosophila غرفة, متحولة الدهون2 كما يقدم مع السلوك الديناميكي المتغيرة من سلسلة الضوء التنظيمي المعدلة الخضراء من myosin II.After مشاهدة هذا الفيديو, يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحليل شبكة أكتوميوسين على نطاق المحلية والأنسجة في غرف البيض Drosophila باستخدام فيجي. للحصول على مزيد من التلميحات العملية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، الرجاء مراجعة جزء المناقشة بعد البروتوكول. إذا كان لديك أي أسئلة تتعلق فيجي أو الإضافات لدينا، راجع صفحات الويب المعنية أو الاتصال بنا.