الكشف على أساس الصفائح الدموية من أكسيد النيتريك في الدم عن طريق قياس الفسفرة بسب

يتناول هذا البروتوكول الاستخدام المحتمل للصفائح الدموية كمستشعر أكسيد النيتريك الحساس للغاية في المختبر وفي الجسم الحي داخل الدم. زيادة الفوسفور فاسوديلات حفز Phosphoprotein أو P-VASP serine 239 في الصفائح الدموية أكسيد النيتريك لديه بعض المزايا، بما في ذلك القدرة على الكشف عن وجود أكسيد النيتريك في أنساب نانومولير. في غضون ساعتين من جمع 30 إلى 50 ملليلتر من الدم كله من متبرع سليم ، أضف خمسة ملليلتر من الدم إلى العدد المناسب من 15 ملليلتر أنابيب مخروطية للطرد المركزي.

استخدام ماصة نقل البلاستيك لجمع بعناية البلازما الغنية بالصفائح الدموية من الجزء العلوي من سراويل. بيليه الصفائح الدموية الغنية بالبلازما مع الطرد المركزي الثاني وغسل بلطف الكريات في خمسة ملليلتر من العازلة CGS. جهاز طرد مركزي عند 400 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الطرد المركزي، resuspend الكريات في ثلاثة ملليلتر من العازلة التيرود المعدلة. استخدم مقياس الهيموسيت للعد وضبط كثافة تعليق الصفائح الدموية إلى ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الثامنة لكل ملليلتر في عازلة التيرود الطازجة. ثم احتضان تعليق الصفائح الدموية لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.

وفي الوقت نفسه، جمع خلايا الدم الحمراء من طبقات البلازما خالية من لوحة من عينات الدم كله عن طريق الطرد المركزي تليها أربعة يغسل في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، تخلص من المواد الخارقة واخلط خلايا الدم الحمراء مع ملليلتر واحد من الصفائح الدموية الغنية بالبلازما في الدم التجريبي المناسب في زجاجات البولي بروبلين المغلقة مع سدادات مطاطية. أدخل إبرة متصلة بخزان غاز الهيليوم في كل سيبتا وأدخل 26 إبر قياس لصنع منافذ الغاز.

ثم دوامة ببطء الزجاجات في درجة حرارة الغرفة واستخدام مقياس الأكسدة لقياس ضغط الأكسجين الجزئي لمراقبة عملية إزالة الأكسجين. معدل انخفاض الأكسجين يعتمد على معدل تدفق الهليوم وسرعة التحريك. لذلك، ينبغي تحسين الوقت من الأوكسجين قبل بدء تجربة لأن هذا يعتمد اعتمادا كبيرا على هندسة الإعداد التجريبي.

للحد من نتريت خلايا الدم الحمراء، استخدم ميكروسرينغ لحقن النتريت من خلال الحاجز في العينات ديوكسيجينيد من PRP وRpcs بحيث يتم تحقيق تركيز نهائي 10 ميكرومولار. احتضان العينات لمدة 10 دقائق على الأقل في 37 درجة مئوية ونقل ملليلتر واحد من كل عينة في أنبوب microcentrifuge للطرد المركزي. نقل 300 ميكرولترات من تعليق الصفائح الدموية من الجزء العلوي من supernatants في أنابيب جديدة microcentrifuge وإضافة dextrose citrate حمض إلى كل أنبوب في نسبة واحد إلى تسعة.

الطرد المركزي الصفائح الدموية مرة أخرى وإعادة تعليق الكريات في 80 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة تحلل التي تحتوي على كوكتيل مثبطات البروتياز ثلاثة لكل أنبوب. بعد ذلك، قم بتحميل 15 ميكروغرام من البروتين من كل عينة إلى نوعين منفصلين من المواد الهلامية SDS-PAGE بنسبة 10٪. تشغيل المواد الهلامية في 120 فولت لمدة 1.3 ساعة.

في نهاية المدى، نقل المواد الهلامية إلى أغشية السليلوز النيتروز الفردية ومنع أي ربط غير محدد مع حجم مناسب من الحليب الجاف غير الدهنية 5٪. احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تليها وضع العلامات مع جسم مضاد بيروكسيديز الفجل الحصان الثانوي المناسب لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم فضح الأغشية مع صورة لتحديد كثافة الفرقة مع برنامج مناسب لتحليل الصور.

عينات الدم الوريدية الصحية لديها قيم ضغط الأكسجين الجزئية بين 50 إلى 80 ملليمترا من الزئبق. إن إزالة الهضاب بواسطة الهيليوم تقلل بسرعة الضغط الجزئي للأكسجين إلى 25 ملليمتراً من الزئبق في غضون 10 دقائق. مزيد من الانخفاض في ضغط الأكسجين الجزئي يمكن تحقيقه مع زيادة الوقت ديوكسيجنيشن.

زيادة إزالة الأكسدة يؤدي إلى زيادة مستويات الانحلال كما هو مبين من قبل البلازما اللون الأحمر على نحو متزايد. هذا هو تأثير إزالة الأكسدة وليس سببه إثارة نفسها كما يدل على ذلك عدم وجود الانحلال في العينات التي أثارها دون الهيليوم. انخفض كل من الفوسفوبروتين المحفز للفوسفوبروتين أو VASP وفوسفوريلات-VASP في الصفائح الدموية مع زيادة ال دموي في عينات deoxygenated كما اكتشفت من قبل لطخة الغربية.

العلاج مع متبرع أكسيد النيتريك قصيرة الأجل يزيد من الفوسفور توسعية حفزت تعبير phosphoprotein في الصفائح الدموية في غضون 10 ثانية من العلاج. علاوة على ذلك، ظلت مستويات الفوسفور-VASP أو P-VASP مستقرة حتى 10 دقائق بعد حضانة المتبرع NO مع البلازما الغنية بالصفائح الدموية مما يشير إلى أن هناك وقتًا كافيًا لفصل كرات الدم من الصفائح الدموية دون التأثير على مستويات P-VASP الموجودة. النتريت أيضا يزيد من مستويات P-VASP الصفائح الدموية في وجود RBCs ديوكسيوجينيد.

هنا تعتمد نسبة P-VASP إلى إجمالي VASP على مستوى الهماتوكريت. و VASP هو التعبير عنها بشدة في الصفائح الدموية، وهو الفوسفورية بسرعة في وجود أكسيد النيتريك. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول طريقة لدراسة تحريض أكسيد النيتريك من المحفزات الفسيولوجية المختلفة.

مع هذا الأسلوب، لقد استخدمنا بنجاح زيادة P-VASP في الصفائح الدموية كعلامة على تحفيز أكسيد النيتريك عن طريق النتريت استنشاق في الجسم الحي. لا تنس أن العمل مع الصفائح الدموية مع عينة بيولوجية يجب أن يتم دائماً باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.