والرزن موائع جزيئية "تقييم التصاق الكريات البيض" إلى "خلايا بطانية" المستمدة من "الخلايا الجذعية Pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان" (هيبسك-ECs)

يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية وتحليل البيانات لتقييم استجابات التحريضية في ECs هيبسك والتحليل لالتصاق الكريات البيض تحت تدفق الفسيولوجية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية حول وظائف واستجابات التهابية للخلايا البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر وصفا مفصلا للإعداد التجريبي وتحليل البيانات لتقييم الالتصاق الكريات البيض للخلايا البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان. لطلاء رقاقة microfluidic، وضع biochip العقيمة في طبق بيتري العقيمة 10 سنتيمترا واستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لحقن 10 ميكرولترات من حل عمل ليفينيكتين الطازجة في كل قناة من الchichip.

غطي طبق بيتري وضعه في غرفة مرطبة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، قبل تسخين الوجبة الحيوية في حاضنة 37 درجة مئوية، وإعادة تعليق الخلايا البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان والمستحثة من 80 إلى 100٪ من الخلايا الناظرة في التركيز المطلوب في وسط جديد خال من المصل الخلايا البطانية. المقبل, التعرق حل fibronectin من جميع قنوات رقاقة microfluidic, وخلط الخلايا تماما للحصول على تعليق الخلية متجانسة قبل استخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لحقن ستة ميكرولترات من الخلايا في كل قناة.

فحص الزكي تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا يتم توزيعها بشكل موحد مع كثافة خلايا عالية. بعد 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، إضافة 40 ميكرولترات من الخلايا البطانية خالية من المصل المتوسطة كاملة في الخزانات المتوسطة على جانبي كل قناة. و أعيدي الـ biochip إلى الحاضنة لمدة ساعة

ثم، إضافة 50 ميكرولترات أخرى من الخلايا البطانية خالية من المصل المتوسطة كاملة في الخزانات على جانبي كل قناة. للتصوير الحي للخلايا المبذرة، تأكد من أن الاجهزة microfluidic جاهزة، أن غرفة التصوير الحية هو توازن إلى 37 درجة مئوية، وأن مستوى CO2 قد وصلت 5٪ ضع الchichip في حامل رقاقة المجهر وجبل حامل رقاقة على مرحلة التصوير المجهر. لتوصيل التعبئة الحيوية إلى المضخة عبر المتشعب، ضع محول ثمانية دبوس على مقربة من خزانات مخرج للرقاقة وتعميق جميع الدبابيس في الوسط دون ربط الدبابيس تماما.

في برنامج مضخة microfluidic ، حدد Washout / Connect إلى chip ، وانقر على تشغيل خطوة المقايسة للاستغناء عن 30 ميكروليترس من المتوسط RPMI من خلال كل دبوس. ثم أدخل محول ثمانية دبوس في منفذ biochip. استخدام ماصة لاستنشاق يدويا المتوسطة من جميع الخزانات مدخل من biochip، وحدد الاغتسال / رقاقة وشوشة وتشغيل خطوة المقس لثقب قناة واحدة في وقت واحد مع 40 ميكرولترات من الخلايا البطانية خالية من المصل المتوسطة كاملة لإزالة أي خلايا ميتة والحطام.

عندما تم غسل جميع القنوات استبدال المتوسطة من خزان مدخل القناة من الفائدة مع 100 ميكرولترات من الكريات البيض الإنسان المخفف إلى 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الستة لكل ملليلتر تركيز في المتوسط RPMI. انقر فوق الخلية Assay / وصف الخطوة وتعيين الحالية القناة / وصف الخطوة وتعيين القناة من الفائدة إلى والقنوات السبع الأخرى إلى إيقاف. حدد وصف الخطوة مقايس الخلية وانقر فوق تشغيل خطوة المقايسة.

استبدل الكريات البيض المتبقية في خزان المدخل بـ 100 ميكرولترات من متوسطة كاملة من RPMI. وانقر على وصف خطوة المقايسة الخلية وتشغيل خطوة المقايسة لثقب القناة لمدة خمس دقائق مع متوسطة RPMI لإزالة أي الكريات البيض غير مخصص. ثم الحصول على الصور من ثلاثة إلى أربعة مواقع مختلفة على الأقل في القناة لتصور الكريات البيض الملتزم بها.

لتحديد كمي الكريات البيض المنضمة فتح برنامج معالجة الصور CellProfiler واستيراد ملف خط أنابيب Count الكريات البيض. ضمن وحدات الإدخال حدد الصور وسحب وإسقاط المجلد مع الصور الأولية من الكريات البيض المنضمة إلى إطار قائمة الملفات. ضمن وحدات التحليل حدد تحديد الكائنات الأساسية والإشارة إلى أقطار الحد الأدنى والأقصى من الكريات البيض المنضمة بالبكسل.

ضمن وحدات التحليل حدد تصفيةObjects. ثم حدد معايير التصفية وأدخل الحد الأدنى من المساحة المقبولة للكائنات بالبكسل وانقر على تحليل الصور لبدء التحليل. وينبغي أن يؤدي تفكك الخلايا البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان إلى تعليق خلية واحدة خالية من كتل الخلية.

عادة، 15 دقيقة بعد الحقن سوف تعلق الخلايا البطانية إلى الجزء السفلي من القناة وتبدأ في الانتشار. في غضون ساعة واحدة من الحقن يجب أن تشكل الخلايا البطانية أحادية الانتشار بشكل جيد عبر القناة التي هي نقطة أنها جاهزة للاستخدام في المقايسة تدفق. يتيح استخدام برنامج معالجة الصور المفتوح المصدر المجاني كما هو موضح تصفية الكائنات المحددة استنادًا إلى مساحة دنيا، واستبعاد الأجسام التي تم التعرف عليها زورًا مثل حطام الخلية أو الفلورة التلقائية أو أي إشارة فلورية غير محددة أخرى.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين التحفيز مع السيتوكينات المؤيدة للالتهابات وإدراج الخلايا البطانية الوريدية السريّة الأساسية كتحكم إيجابي. لا تنس أن العمل مع خلايا الثدييات الأساسية وخطوط الخلايا يمكن أن تكون خطرة للغاية وأن الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات وحماية العين يجب أن تتخذ دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.