في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب الأنظمة. مثل كيف أن نشاط الفرق العصبية يدعم المعالجة الحسية والمعرفية في الدماغ. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل الاستهداف الدقيق للبروتينات البصرية مثل تشان رودوpsسين وGCaMP لمناطق الدماغ ذات الاهتمام، دون الحاجة إلى إجراء حقن فيروس منفصل.

إن البرهان المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث أن ترسب الحرير والفيروسات إلى غرسات بصرية صغيرة يمكن أن يستغرق بعض الممارسة من أجل تحقيق نتائج قابلة للتكرار. أولاً، ذاب المزيج AAV وخمس إلى سبع نقاط خمسة في المئة من الحرير مائي ليفي في نسبة واحد إلى واحد في أنبوب PCR 200 ميكرولتر. بلطف ماصة الحل داخل وخارج عدة مرات لخلط تماما AAV والليفي.

لإيداع الحرير / AAV، تحميل ماصة حقن مع كمية من الحل المطلوبة لعدد من يزرع الألياف التي يجري إجراؤها، بالإضافة إلى ما يقرب من 30 في المئة اضافية لاستيعاب الخسائر الناجمة عن انسداد الماصات. المقبل، جبل حامل فيرول في جهاز ستيريويكسيكس مجهزة بضجين صغير. ضع حامل الزفير فوق المُقَدِر وتطبيق خليط الحرير/AAV من الأسفل.

مناورة ماصة الحقن حتى يتم لمس أو لمس ما يقرب من مركز سطح الألياف البصرية، وإخراج 10 إلى 20 نانولترات من حل الحرير / AAV. ثم، سحب الماصة. بعد ذلك ، لاحظ بوليوس الحرير / AAV على السطح المسطح الذي يظهر كقبة سائلة تجف على فيلم مسطح في غضون دقيقة واحدة تقريبًا.

كرر الخطوات السابقة حتى يتم إيداع المبلغ المطلوب من الحرير / AAV. عند إعداد غرسات متعددة، ضعي محلول الحرير/AAV على غرسة واحدة ثم انتقل إلى معطف الغرسات الأخرى، قبل العودة إلى الأولى. بعد ساعة واحدة من التجفيف، ضع حامل النهمة بأكمله في غرفة فراغ وفراغ جفاف بين عشية وضحاها في حوالي 125 تور وأربع درجات مئوية.

في اليوم التالي، قم بتقييم شكل ومكانة فيلم الحرير الناتج تحت مجهر عالي الطاقة. تأكد من أن الأفلام محصورة في طرف سطح الألياف البصرية، رقيقة نسبيا، ومتناظرة. للطلاء مدبب الألياف البصرية، ضع ماصة حقن الحرير/AAV ضد جانب الألياف البصرية في بداية التفتق، والتأكد من أن الماصات لمس الألياف البصرية.

Eject 20 نانويت من الحرير / AAV لبدء عملية الطلاء، وضمان أن القطرة تلتزم الألياف البصرية وتبقى في واجهة الألياف والماصات. بلطف الفتيل قطرات نحو نهاية تلميح الألياف كما يجف الحرير / AAV، والحفاظ على ماصة الحقن في اتصال مع قطرات التجفيف لتجنب انسداد تلميح ماصة. عندما قد جفت البلوس الأول تماما تقريبا، وطرد آخر 20 نانويلتر ومواصلة فتل قطرة على طول تفتق.

كرر الخطوة السابقة عن طريق إخراج كميات صغيرة من الحرير / AAV ، وتجفيف الحل تدريجيا حتى جانب التفتق. بعد التجفيف، تقييم شكل وموقف من فيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة. لطلاء عدسة GRIN يزرع، إيداع الحرير / AAV في حقنة واحدة على زرع عدسة GRIN.

بعد التجفيف، قم بتقييم شكل وضعية فيلم الحرير الناتج تحت مجهر عالي الطاقة لضمان أن يغطي الفيلم سطح العدسة. لطلاء الزجاج القحفية النوافذ، اليد ماصة قطرة خمسة ميكرولتر من الحرير / AAV على سطح زلة غلاف جولة ثلاثة ملليمتر بحيث تنتشر قطرات خارج لتغطية سطح الزجاج بأكمله. بعد التجفيف، قم بتخزين الألياف البصرية المغلفة بالحرير/AAV في جهاز تجفيف فراغي مبرد عند 125 تور وأربع درجات مئوية قبل زرع الأجهزة.

قدمت صور الفلوريسنس للبروتينات البصرية الموسومة بالفلوروهور مقياسًا لمدى التعبير عن أفلام الحرير / AAV ، ويمكن للألياف البصرية النموذجية استيعاب 200 نانويلتر من الحرير / AAV بسهولة. مع الممارسة، يمكن للمجربين تحقيق تعبير موثوق به للغاية حول غيض من الألياف المزروعة. هناك مسألتان محتملتان مع النوافذ القحفية المغلفة هما التعبير غير الكافي، وأفلام الحرير التي تفشل في الذوبان، وتحجب مجال الرؤية.

لزيادة التعبير، يمكن إجراء استئصال الزجري قبل زرع النافذة، و/ أو زيادة كمية الفيروس في الفيلم. تم تحقيق أفضل تعبير باستخدام خليط واحد إلى أربعة من الحرير والأوراق المالية AAV، على التوالي. كمية الحرير في النوافذ المطلية هي 10 إلى 100 مرة أكثر من يزرع الألياف، والفيلم هو أقل جزءا لا يتجزأ في الأنسجة، وبالتالي قد لا تتعرض لنفس مستويات النشاط البروتيوليك التي يمكن أن تذوب أفلام الحرير.

ومع ذلك ، فإن وجود بعض الحرير ضروري لتحقيق التعبير الخاص بك تحت النوافذ ، على الأرجح لأن الفيلم المصنوع من الفيروس وحده يتم غسله من قبل السائل الخلالي أثناء الجراحة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم إعداد وتخزين الغرسات المغلفة بالحرير بالطريقة التي نصفها. قد يؤدي التخزين غير السليم إلى تغيير خصائص أفلام الحرير، أو تقليل فعالية متجهات التعبير الفيروسي.

يمكن أن تكون هذه التقنية ذات فائدة كبيرة للباحثين في مجال علم الأعصاب في مجال الأنظمة لاستكشاف كيفية دفع النشاط العصبي للمعالجة الحسية والمعرفية في أدمغة الثدييات مثل الفئران أو الفئران أو حتى الرئيسيات غير البشرية. لا تنس أن العمل مع ناقلات التعبير الفيروسية يمكن أن تكون خطرة ومعدات الحماية الشخصية، مثل القفازات، نظارات واقية، ومعاطف المختبر، ينبغي أن ترتديه دائما أثناء العمل مع الفيروس المرتبطة أدينو.