Name: في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: اكتشف طريقة توصيل البروتينات الأوبتوجينيتيكية المستهدفة إلى مناطق الدماغ باستخدام أفلام الحرير/AAV. تُبسّط هذه التقنية عملية زرع الفيروسات وتُحسّن دقة التدخلات العصبية في دراسات علوم الأعصاب.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أود أن أشكر فاسكويز جيه للرسوم التوضيحية وكابلان دال وجيم بريدًا الكواشف وتوجيهات مفيدة، ومختبرات ساباتيني باء وجيم هارفي للتصوير في فيفو . الفحص المجهري وأمكن أوكانا م ومركز تصوير بيولوجيا الأعصاب، تدعمها جزئيا مركز التصوير العصبي كجزء من "الوطني المعهد من الاضطرابات العصبية" و "السكتة الدماغية" (NINDS) P30 الأساسية مركز منح (NS072030). وأيد هذا العمل من مؤسسة الأسرة خوداداد جبر، والمؤسسة، و "علامات لوري نانسي" بمنح المعاهد الوطنية للصحة، R21NS093498 نيندس، U01NS108177 و R35NS097284 نيندس إلى W.G.R، ومن المعاهد الوطنية للصحة ما بعد الدكتوراه زمالة F32NS101889 إلى C.H.C.

أجريت جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها "اللجنة الدائمة هارفارد" في "رعاية الحيوان" ووصف المبادئ التوجيهية التالية في "المعاهد الوطنية للصحة لنا" دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. واستخدمت الفئران C57BL/6 الكبار من كلا الجنسين (6-15 أسبوعا عمر) لجميع التجارب.
1-الحصول على فيبروين الحرير مائي
<ol><li>إعداد أو شراء fibroin الحرير مائي (5-7.5% w/v).</li>
</ol>2-خلط مائي الحرير مع ناقلات التعبير إف
<ol><li>اختر متجه تعبير إف محرك البروتين أوبتوجينيتيك أو مؤشر الفلورسنت الاختيار. ملاحظة: للتقليل من حجم الحرير/إف التي يجب تطبيقها ليزرع أثناء القيادة لا تزال قوية التعبير، ينصح إف عيار الأوراق المالية (الأسهم التتر الحصول عليها عادة من النوى ناقلات حوالي ~ 1013 gc/mL).</li>
	<li>قبل مباشرة يزرع طلاء، ذوبان الجليد قاسمة إف والجمع fibroin الحرير مائي 5-7.5 ٪ (سيشار إلى هذا الخليط كالحرير/إف). في أنبوب بكر 200 ميليلتر، مزيج فيبروين المائية واف في نسبة 1:1 (لاستخدام windows الجمجمة 1:4) قبل التطبيق مباشرة. بلطف "الماصة؛" الحل والخروج عدة مرات مزيج دقيق fibroin واف.</li>
	<li>تبقى خليط الحرير/إف على الجليد قبل استخدامها.</li>
</ol>3-إعداد المعدات لتصنيع وتخزين أجهزة الحرير/إف-المغلفة
<ol><li>شراء معدات لطلاء الألياف الضوئية والعدسات متدرجة-فهرس (ابتسامة) (الأرقام 1، 2).<ol>
<li>بناء حامل التسليح مستقرة. عقد الحلقات, والسيراميك، وحفر ثقوب 1.25 ملم في كتلة من ورقة اﻷكريليك ¼ ". اضغط على ثقوب لإدراج مجموعة مسامير من الجانب لعقد الحلقات, وفي المكان. ملاحظة: يمكن استخدام أي المشبك لهذا الغرض.</li>
		<li>ضع مناور بدقة ملليمتر الفرعية لنقل الألياف الضوئية (جهاز ستيريوتاكسيك أو ميكرومانيبولاتور الدقيقة الأخرى).</li>
		<li>تجميع حامل مستقرة لتحديد موضع في ميكروينجيكتور.</li>
		<li>استخدام ستيريوسكوبي لتصور التجميعية الحرير والألياف البصرية.</li>
		<li>ضع مصدر ضوء لإضاءة الألياف البصرية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد المعدات لدهان الجمجمة windows (الشكل 3).<ol>
<li>اختيار أي بيبيتور P10.</li>
		<li>الحصول على حاوية مع غطاء. ملاحظة: يتم اقتراح أي حاوية مع قاع سيليكون – الجزء السفلي لينة يسهل رفع النوافذ الجمجمة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد المعدات لتخزين يزرع الانتهاء (الشكل 4).<ol>
<li>الحصول على فراغ (1-5 لتر) غرفة صغيرة.</li>
		<li>تأكد من أن هناك مساحة لتخزين يزرع في ثلاجة 4 درجات مئوية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-تطبيق الفيلم الحرير/إف للأجهزة
<ol><li>طلاء الألياف الضوئية للتعبير تنسيق محرك الأقراص على طرف الألياف
	<ol>
<li>إعداد يزرع الألياف المزمن كما هو موضح سابقا4.</li>
		<li>قبل الشروع في الاستخدام، شطف يزرع مع الإيثانول، ثم مع الماء عالي النقاوة للتأكد من أن الألياف الضوئية نظيفة. ملاحظة: الأفلام الحرير التقيد أكثر موثوقية لتنظيف أسطح الزجاج.</li>
		<li>تحضير جهاز لعقد الحلقات, والألياف. مم للحلقات, نموذجية 1.25 مم وقطرها استخدام كتلة اﻷكريليك واضحة، مع ~1.3 ¼ بوصة الثقوب، وتستغل مجموعة مسامير تدخل من الجانب إلى ثقب يزرع بشدة في مكان (الشكل 1A).</li>
		<li>جبل صاحب التسليح في جهاز ستيريوتاكسيك (أو أي حل التلاعب بدقة سوبميليميتير) مجهزة ميكروينجيكتور. مكان صاحب التسليح أعلاه ميكروينجيكتور وتطبيق الخليط الحرير/إف من الأسفل. ملاحظة: هذا بسبب التطبيقات كميات كبيرة من فوق أسفرت الحرير/إف أن لم يكن مقصورا على الحافة. ومع ذلك، يمكن أن تنتج تطبيق العديد من أحجام صغيرة متسلسلة من أعلى أو أسفل الودائع إف/الحرير التي تقتصر على الطرف (على الرغم من أننا نفضل أن تطبق من الأسفل).</li>
		<li>سحب ماصة حقن داخل الجمجمة قياسية من زجاج البورسليكات الشعرية.<ol>
<li>لتجعل من السهل على</li>
			<li>لإنتاج نصيحة حقن مع تلميح شقة نظيفة للقطر المطلوب وعقد ماصة واحدة في كل جهة واستخدم الجزء أكثر سمكا من تفتق على ماصة واحدة لنقاط ماصة أخرى في موقع فاصل المطلوب.</li>
			<li>فرك بلطف ذهابا وإيابا في حركة سونج (أسلوب التهديف الزجاج على الزجاج).</li>
			<li>بعد التسجيل الماصة، تطبيق ضغط لطيف على غيض ماصة سجل مع جثة ماصة أخرى لتحقيق الانفصال.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ضع ستيريوسكوبي لإعطاء فكرة واضحة عن وجوه الألياف الضوئية. ملاحظة: يجب أن يكون التكبير كافية بدقة موقف ماصة حقن أعلاه على وجه الألياف الضوئية.</li>
		<li>إدراج يزرع الألياف مع الجانب الدماغ من الألياف الضوئية التي تواجه أسفل حامل.</li>
		<li>تحميل ماصة حقن مع حل الحرير/إف، أما بالنسبة لأي معيار الحقن داخل الجمجمة5. تحميل المبلغ المطلوب لعدد يزرع تبذل، بالإضافة إلى ~ 30% إضافية لاستيعاب الخسائر بسبب انسداد الماصات. على سبيل المثال، إذا كان يتم إجراء عملية زرع 10، ثم تحميل مع 100 nL الودائع وسحب ~1.3 ميليلتر. ملاحظة: قد تجف الحرير/إف في تلميح ماصة بين الانقذافات، التي يمكن أن تسد الماصة. كبيرة قطرها الماصات (50-100 ميكرومتر) أقل احتمالاً لتسد. يمكن فكها قباقيب بالفرشاة لطيف أسفل طرف الماصة مع مسحه مسح أو الكحول ورق رطب.</li>
		<li>مناورة ماصة حقن حتى يتم لمس أو لمس تقريبا وسط سطح الألياف الضوئية. إخراج nL 10-20 لحل الحرير/إف. سحب الماصة. ملاحظة: أن معدل الولادة ليست حاسمة، ولكن معدلات نموذجية هي 5-20 nL/s.</li>
		<li>نلاحظ بولس من الحرير/إف على سطح مسطح الذي يظهر كقبة سائل الذي يجف لفيلم شقة داخل ~ 1 دقيقة (الشكل 1B).</li>
		<li>كرر الخطوات 4.1.9-4.1.10 حتى المبلغ المطلوب من الحرير/إف أودعت (أي ما مجموعة 20-200 nL لمعظم التطبيقات). عند إعداد يزرع متعددة، تطبيق الحرير/إف لزرع واحد وثم الانتقال إلى معطف أخرى يزرع قبل العودة إلى الأولى.</li>
		<li>تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.</li>
		<li>فراغ بين عشية وضحاها ديسيككاتي في ~ 125 عربة (-25 في. Hg)، 4 درجة مئوية. القيام بذلك عن طريق وضع صاحب أسرة التسليح في فراغ غرفة.</li>
		<li>تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة. ضمان أن تقتصر الأفلام غيض سطح الألياف الضوئية، وأن تكون رقيقة نسبيا (> 100 ميكرومتر)، ومتناظرة (الشكل 1). ملاحظة: قد إزاحة كبيرة أو غير متناظرة من أفلام الحرير/إف من الألياف أثناء غرس (الشكل 1). السبب الأكثر شيوعاً لمشاكل ناشئة عن تطبيق كميات كبيرة واحدة بدلاً من تطبيق العديد من أحجام صغيرة متتالية.</li>
	</ol></li>
	<li>طلاء مدبب الألياف البصرية إلى التعبير بالسيارة على طول محور الألياف
	<ol>
<li>الحصول على الألياف الضوئية مدبب يزرع وإجراء الخطوات 4.1.2-4.1.8، إلا أن الألياف مدبب يوضع أفقياً فإنه يكون عمودي على محقن (الشكل 2A). موقف الحاقن أعلاه الألياف مدبب. ملاحظة: تحميل قطيرات على ألياف مدبب يشكل إضافة التحديات، نظراً للتوتر السطحي يميل إلى يسبب قطرات القفز إلى الوراء على ماصة الحقن أو ترحيل إعداد الألياف مدبب. أصغر حقن الماصات (30-50 ميكرون القطر) تساعد على التغلب على هذه المشكلة ولكن زيادة الخطر الذي سوف تسد ماصة حقن. بسبب التوتر السطحي، قطرات تميل إلى التمسك بمجال أكبر من المساحة السطحية، لذلك حقن الأمثل "الماصة؛" الحجم يعتمد على حجم الألياف مدبب والتسامح واحد لتسد أحياناً.</li>
		<li>ضع ماصة حقن الحرير/إف ضد الجانب من الألياف الضوئية في بداية تفتق. تأكد من أن يلمس ماصة حقن الألياف الضوئية.</li>
		<li>إخراج 20 nL من الحرير/إف لبدء عملية الطلاء. ضمان أن الحبرية تتمسك بالألياف الضوئية، وما زال في الواجهة من الألياف/الماصة. فتيلة الحبرية نهاية طرف الألياف بلطف كما يجف الحرير/إف (~ 45 ثانية). تبقى ماصة الحقن على اتصال مع الحبرية التجفيف لتجنب انسداد طرف ماصة. ملاحظة: ينبغي أن معطف كل إيداع ما يقارب 400 ميكرون من الألياف مدبب (الشكل 2).</li>
		<li>عند بولس الأول قد جفت تماما تقريبا، إخراج آخر 20 nL ومواصلة فتل الحبرية على طول تفتق. ملاحظة: سوف تتمسك الحرير السائل بالحرير المجففة، ترسيخ واحدة من نهاية الحبرية ماصة تتحرك على طول تفتق.</li>
		<li>كرر الخطوة 4-2-4 بإخراج كميات صغيرة من الحرير/إف، والرسم الحل الذي يصل إلى جانب تفتق تدريجيا. 5-6 الانقذافات تكفي لاجتياز سطح تفتق 2.5 ملم.</li>
		<li>لدفع المزيد من التعبير موحدة حول كافة جوانب من الألياف، تدوير الألياف وكرر الخطوات 4.2.2-4.2.5 حتى بعد إيداع المبلغ المطلوب من الحرير/إف.</li>
		<li>إذا شنقاً حبلا من المجففة الحرير/إف يمتد إلى أبعد من طرف الألياف، قطع حبلا عناية مع مقص، أو استخدام ماصة الإخراج لثني حبلا العودة والتمسك بأنها تفتق الألياف.</li>
		<li>تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.</li>
		<li>فراغ بين عشية وضحاها ديسيككاتي في 4 درجات مئوية. يمكن وضع صاحب أسرة التسليح في فراغ غرفة.</li>
		<li>تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة. ملاحظة: الأفلام لا يلزم أن تكون موحدة تماما ولكن لا ينبغي أن تكون المطبات التي تمتد أكثر من 100 ميكرومتر خارج سطح الألياف للتقليل من الضرر للأنسجة المحيطة من خلال غرس (الشكل 3). لتصغير حجم الفيلم، من الأهمية بمكان أن كل قطره جافة تماما قبل الإيداعات اللاحقة.</li>
	</ol></li>
	<li>عملية زرع العدسة ابتسامة طلاء
	<ol>
<li>الحصول على ابتسامة العدسات6،7 وكرر الخطوات 4.1.2-4.1.8. يمكن تركيبة الحاقن أعلاه.</li>
		<li>إيداع الحرير/إف في قذف واحدة (1 ميليلتر لعدسة قطرها 1.0 مم). ملاحظة: هذا سيؤدي إلى قبة سائل أن تتمسك بوجه العدسة، ويجفف لإنتاج فيلم موحدة (100-200 ميكرومتر سميكة). ومع ذلك، في حالة ما إذا يجف موزعة قذف كبير واحد وتنتج فيلم الذي أكثر سمكا قرب حواف العدسة ابتسامة، حاول إيداع قطرات أصغر متعددة (100-200 nL) في وسط سطح العدسة (السماح لكل قطره الجافة قبل إيداع القادم) لضمان أن الفيلم سيكون محرك التعبير في مركز مجال الرؤية.</li>
		<li>تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.</li>
		<li>تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة لضمان أن الفيلم يغطي سطح العدسة.</li>
	</ol></li>
	<li>طلاء زجاج النوافذ الجمجمة
	<ol>
<li>إعداد الزجاج ويندوز الجمجمة المنضمة قطرها 3 مم اثنين جولة كوفيرسليبس (سمك رقم 1) إلى نافذة واحدة قطرها 5 ملم بمادة لاصقة الضوئية (لمزيد من التفاصيل، انظر جولديي وآخرون عام 20148).</li>
		<li>مزيج من الحرير: الفيروس بنسبة 1:4 لتخفيض المبلغ الإجمالي للحرير في الفيلم. لا تذوب كميات مفرطة من الحرير تحت windows الجمجمة بعد زرع. قد يلزم تجارب المعايرة لتحديد نسبة وحجم الذي يعطي الشخصية التعبير المطلوب.</li>
		<li>اليد "الماصة؛" معالجة تجميعية 5 ميليلتر على السطح ساترة 3 مم (المواجه للدماغ). وينبغي أن تنتشر الحبرية لتغطية سطح الزجاج كامل (الشكل 3).</li>
		<li>تسمح ح 2-3 للتجفيف قبل نقل الإطارات.</li>
	</ol></li>
</ol>5-تخزين يزرع الحرير/إف-المغلفة
<ol><li>تخزين الحرير/إف-المغلفة الألياف الضوئية في مجفف فراغ تبريد (~ 125 عربة، 4 درجة مئوية) قبل استخدام (الشكل 4 أ).</li>
	<li>لا تقم بتخزين windows الجمجمة والعدسات ابتسامة تحت الفراغ، حيث أن الأفلام الحرير الكبيرة المخزنة تحت فراغ لا تذوب تماما بعد زرع. زرع نوافذ الجمجمة والعدسات ابتسامة فورا بعد التجفيف، أو خلال يوم من صنعها إذا كانت مخزنة في الضغط الجوي و 4 درجة مئوية.</li>
</ol>6-غرس الأجهزة
<ol><li>إعداد الحيوانات لجراحة زرع كما هو موضح سابقا4.<ol>
<li>بإيجاز، تخدير الفئران مع حقن داخل من الكيتامين/إكسيلازيني (100/10 مغ/كغ) وتحقق من عمق التخدير باستخدام إصبع القدم-قرصه لطيف. يحلق في الجمجمة في مجال الزرع وتنظيف فروة الرأس مع اليود والكحول.</li>
		<li>جبل الحيوانات في جهاز ستيريوتاكسيك وتكملة التخدير باستخدام خليط من الأوكسجين وإيسوفلوراني (1-2%). جعل شق في فروة الرأس أكثر من مجال الاهتمام، وتؤدي اوديما كبيرة بما يكفي لاستيعاب عملية الزرع.</li>
	</ol>
</li>
	<li>زرع الألياف البصرية9 وميكروندوسكوبي العدسات10 وفقا لإجراءات سبق نشرها. مقبض يزرع بعناية، كما يمكن أن تربعت إيداع الحرير/إف اوديما ناقصة، أو بزرع الأنظار على حافة الجمجمة. انخفاض عملية الزرع في الدماغ ببطء (~ 2 مم/دقيقة).</li>
	<li>زرع windows الجمجمة كما وصف سابقا8. لا تلمس الجانب المغلفة إطار وتجنب الشطف النافذة مع السائل إذا كان أداء تزقيمية مدتها، كهذا قد يغسل الفيروس. لتحقيق أقصى حد من التعبير، أداء دوروتومي.</li>
</ol>7-تقييم التعبير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
<ol><li>تقييم تعبير البروتينات أعرب فيروسي، تسمح ~ 2-3 أسابيع بالنسبة للفيروس إلى محرك التعبير، ثم إجراء نضح إينتراكارديال مع بارافورمالدهيد 4 ٪ في الفوسفات مخزنة أنسجة المخ11 وعملية المحلول الملحي في فلوري 12من الفحص المجهري.</li>
	<li>تقييم التعبير باستخدام مجهر فلوري الصورة في نمط التعبير للبروتينات أوبتوجينيتيك معلم فلوروفوري.</li>
	<li>في حالة عدم كفاية مستوى التعبير، زيادة كمية الفيروس في الطلاء أما زيادة الحجم الإجمالي لطلاء الحرير/إف، أو يفضل أن يتم ذلك باستخدام فيروس عيار أعلى.</li>
</ol>

<ol><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Tervo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+Fibroin+Films+Facilitate+Single-Step+Targeted+Expression+of+Optogenetic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins.</a> Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e50004(2012).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+sectioning+of+slice+preparations+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), 194(2007).</li>
<li>Cao, Y., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+silk+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of silk biomaterials.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).</li>
<li>Hines, D. J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+controlled+release+from+silk+fibroin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of controlled release from silk fibroin films.</a> Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+silk+material+structure+by+temperature-controlled+water+vapor+annealing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing.</a> Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-induced+injectable+silk+fibroin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels.</a> Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).</li>
<li>Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication-induced+gelation+of+silk+fibroin+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).</li>
<li>Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+repeatable+fabrication+of+high+A%2FR+silk+fibroin+microneedles+using+thermally-drawn+micromolds%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds.</a> European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

استخدام الحرير/إف أن تستهدف التعبير عن البروتينات أوبتوجينتيك ويتغلب على القيود المفروضة على النهج التي قيد الاستخدام حاليا. على الرغم من أن العديد من الدراسات بنجاح استخدام حقن إف للتعبير عن البروتينات أوبتوجينيتيك، أنها تمثل تحديا لمحاذاة التعبير إلى غيض الألياف الضوئية وإلى المناطق المحيطة بطول ألياف مدبب، وإلى منطقة العرض لعدسة ابتسامة. بسبب اختلال بين المكونات البصرية والتعبير أوبتوجينيتيك، حقن ستيريوتاكسيك يمكن الاعتماد عليها، وفشل العديد من التجارب. الحرير/إف وسم الأسلوب يصف لنا هنا يحل هذه المشكلة. كما أنه يبسط ا...

العقد الماضي أسفر انفجار هندسة البروتينات حساسة للضوء لرصد ومعالجة النشاط العصبي1. فيروسات توفر مرونة لا مثيل لها للتعبير عن هذه الأدوات أوبتوجينيتيك في المخ. وبالمقارنة بالحيوانات المحورة وراثيا، الفيروسات أسهل بكثير لإنتاج ونقل وتخزين والسماح بالتنفيذ السريع لأحدث أدوات أوبتوجينيتيك. يمكن استهداف التعبير وراثيا للسكان العصبية متميزة، والفيروسات المصممة لنقل إلى الوراء حتى يمكن أن تستخدم لاستهداف التعبير استناداً إلى اتصال الخلايا العصبية2.
عادة ما يتم إدخال الفيروسات مع حقن ستيريوتاكسيك، التي يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. دقة استهداف المناطق الصغيرة يمكن أن تكون صعبة، بينما القيادة التعبير أكثر مجالات واسعة كثيرا ما يتطلب العديد من الحقن. وعلاوة على ذلك، عندما يكون جهاز بصري مزروع في وقت لاحق في الدماغ لتسليم الخفيفة في فيفو، عملية الزرع يجب أن تكون محاذاة بشكل صحيح مع حقن الفيروسية. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنفيذها بسهولة عن تسليم ناقلات الأمراض الفيروسية للأنسجة حول جهاز مزروع باستخدام الحرير fibroin الأفلام3. فيبروين الحرير المتاحة تجارياً، ويتغاضى عنها جيدا بالانسجة العصبية، ويمكن استخدامها لإنتاج مواد ذات خصائص متنوعة. يمكن تطبيقها ليزرع باستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل الماصات microinjection أفلام الحرير أو من ناحية الماصات. الأفلام الحرير/إف إلغاء شرط اثنين العمليات الجراحية والتأكد من أن الفيروس بوساطة التعبير بشكل صحيح محاذاة لزرع الضوئية. التعبير الناتج مقيد إلى غيض من الألياف، والنتائج في أقل تعبير غير المرغوب فيها على طول مسار الألياف من حقن ستيريوتاكسيك.
بالإضافة إلى إنتاج التعبير المستهدفة في غيض من ألياف صغيرة، يمكن استخدام أفلام الحرير/إف لحملة على نطاق واسع (> 3 مم) التعبير القشرية تحت windows الجمجمة. في فيفو التصوير 2-فوتون من أجهزة الاستشعار النشاط الفلورسنت أصبحت أداة لا غنى عنها لتقييم دور نشاط الخلايا العصبية في القيادة المعالجة الحسية والمعرفية. ومع ذلك، أداء التعبير على مناطق واسعة القشرية، المجربون في كثير من الأحيان لقيادة موحدة حقنات متعددة. هذه الحقن يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً، ويمكن أن يؤدي إلى التعبير غير متناسقة عبر مجال الرؤية. وفي المقابل، الحرير/إف-المغلفة النوافذ الجمجمة سهلة للغاية صنع ويقلل كثيرا من الوقت اللازم للعمليات الجراحية، وآخر ملحوظ محرك التعبير مئات ميكرون تحت السطح القشرية.

الألياف <table><tbody><tr><td>الحريرية المائية</td><td>Sigma</td><td>5154-20ML</td> الحرير <td>المائي الفيبروين (5٪ وزن / حجم) لصنع الأفلام</td></tr><tr><td>حاقن دقيق لإيداع الحرير / AAV</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td>حاقن نانولتر نانو جيكت III</td></tr><tr><td>مناور لعقد الغرسات</td><td>Narashige</td><td>MM-33</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>مجسم لتصور رواسب الحرير</td><td>AmScope</td><td>SM-6TX-FRL</td><td>3.5X-45X مجهر تكبير مفصلي ثلاثي العينيات مع حلقة ضوء</td></tr><tr><td>غرفة فراغ لتخزين الغرسات</td><td>Ablaze</td><td>N / A</td><td>3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber</td></tr><tr><td>اختياري ، حامل زرع للتخزين</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>لتخزين الألياف الضوئية الجاهزة ، قم بحفر شبكة من ثقوب بعمق ~ 4 مم بقطر أكبر بقليل من قطر الطويق في كتلة بلاستيكية.</td></tr><tr><td>الألياف الضوئية</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td> <td>& Oslash; 200 وميكرو ؛ m الأساسية الألياف الضوئية متعددة الأوضاع لغرسات الألياف الحلقات</td></tr><tr><td></td><td>Kientec</td><td>FZI-LC-230</td><td>LC زركونيا الطويق لزراعة الألياف</td></tr><tr><td>مواد مختلفة لتصنيع غرسات الألياف المزمنة</td><td>مختلف</td><td>N / A</td><td>للحصول على إجراء مفصل ، انظر Ung K ، Arenkiel BR. زرع الألياف البصرية للتحفيز البصري المزمن لأنسجة المخ. مجلة التجارب المتصورة: JoVE. 2012 (68).</td></tr><tr><td>يزرع الألياف المدببة</td><td>Optogenix</td><td>Lambda-B</td><td>يزرع الألياف المدببة</td></tr><tr><td>عدسات GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLH-100-WD002-002-SSI-GF3</td><td>عدسات GRIN نوافذ</td></tr><tr><td>الجمجمة الزجاجية الصغيرة</td><td>Warner</td><td>64-0726 (CS-3R-0)</td> <td>زجاج غطاء دائري صغير ، سمك # 0</td></tr><tr><td>نوافذ جمجمة زجاجية كبيرة</td><td>Warner</td><td>64-0731 (CS-5R-0)</td> زجاج <td>غطاء دائري صغير ، سمك</td></tr> <tr><td># 0مواد مختلفة لتصنيع نوافذ الجمجمة</td><td>مختلفة</td><td>غير متوفرة</td><td>للحصول على إجراء مفصل ، انظر Goldey GJ et al. نوافذ الجمجمة القابلة للإزالة للتصوير طويل الأمد في الفئران المستيقظة. بروتوكولات الطبيعة. 2014 نوفمبر; 9 (11): 2515.</td></tr></tbody></table>

في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

السعي فهم كيف العصبية دوائر المعلومات العملية من أجل إخراج محرك الأقراص السلوكية قد ساعد إلى حد كبير بوسائل بصرية وضعت مؤخرا للتلاعب ورصد نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي. تعتمد هذه الأنواع من التجارب على عنصرين رئيسيين هما: 1) القابلة للغرس من الأجهزة التي توفر الوصول البصرية إلى الدماغ، والبروتينات 2) حساسة للضوء أن تغيير استثارة الخلايا العصبية أو تقديم قراءات لنشاط الخلايا العصبية. وهناك عدد من الطرق للتعبير عن البروتينات حساسة للضوء، ولكن الحقن ستيريوتاكسيك من النواقل الفيروسية حاليا النهج الأكثر مرونة لأنه يمكن التحكم في التعبير بدقة الوراثية والتشريحية والزمانية. على الرغم من فائدة كبيرة من النواقل الفيروسية، إيصال الفيروس إلى الموقع الذي يزرع الضوئية يطرح العديد من التحديات. حقن فيروس ستيريوتاكسيك يطالبون بالعمليات الجراحية التي زيادة وقت الجراحة، وزيادة تكلفة الدراسات، وتشكل خطرا على صحة الحيوان. يمكن أن تتلف الأنسجة المحيطة فعلياً بحقنه الحقن ومكسبه الالتهابات الناجمة عن تسليم المفاجئ بلعه فيروسات عالية-عيار. محاذاة الحقن مع يزرع الضوئية ومن الصعوبة عند استهداف المناطق الصغيرة في أعماق الدماغ. للتغلب على هذه التحديات، يمكننا وصف طريقة لطلاء أنواع متعددة من يزرع بصري مع الأفلام تتكون من الحرير fibroin ومتجهات (إف) الفيروسية المرتبطة بالغدة. يمكن تغليف بوليمر المستمدة من الشرنقة من موري بومباي، فيبروين، وحماية الجزيئات الحيوية ويمكن معالجتها في أشكال تتراوح بين الأفلام القابلة للذوبان للسيراميك. عند زرعها في الدماغ، الطلاء الحرير/إف الإفراج عن الفيروسات في مجال التفاعل بين العناصر البصرية والدماغ المحيطة بها، ويقود التعبير تحديداً حيث أنه مطلوب. هذا الأسلوب هو تنفيذها بسهولة ويبشر بأن ييسر إلى حد كبير في فيفو دراسات مهمة الدائرة العصبية.

لتقييم نجاح الأفلام الحرير/إف في قيادة التعبير، نحن perfused الحيوانات 2-3 أسابيع بعد زرع وإعداد شرائح الدماغ من المنطقة من الفائدة. صور الأسفار من البروتينات أوبتوجينيتيك معلم فلوروفوري (ChR2-يفب) تقدم مقياسا لمدى تعبير (الشكل 1). الألياف الضوئية النموذجية (230 ميكرومتر القطر) يمكن سهولة استيعاب 200 nL من الحرير/إف. مع الممارسة، يمكن تحقيق المجربون التعبير موثوق بها للغاية حول غيض من ألياف مزروع (الشكل 5).
<p class="jove_con...

وهنا نقدم طريقة لإيصال النواقل الفيروسية التعبير في الدماغ باستخدام الأفلام fibroin الحرير. هذا الأسلوب يسمح التنفيذ الهادف لناقلات التعبير باستخدام الألياف البصرية المغلفة بالحرير/إف ومدبب من الألياف الضوئية ونوافذ الجمجمة.

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب الأنظمة. مثل كيف أن نشاط الفرق العصبية يدعم المعالجة الحسية والمعرفية في الدماغ. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل الاستهداف الدقيق للبروتينات البصرية مثل تشان رودوpsسين وGCaMP لمناطق الدماغ ذات الاهتمام، دون الحاجة إلى إجراء حقن فيروس منفصل.إن البرهان المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث أن ترسب الحرير والفيروسات إلى غرسات بصرية صغيرة يمكن أن يستغرق بعض الممارسة من أجل تحقيق نتائج قابلة للتكرار. أولاً، ذاب المزيج AAV وخمس إلى سبع نقاط خمسة في المئة من الحرير مائي ليفي في نسبة واحد إلى واحد في أنبوب PCR 200 ميكرولتر. بلطف ماصة الحل داخل وخارج عدة مرات لخلط تماما AAV والليفي.لإيداع الحرير / AAV، تحميل ماصة حقن مع كمية من الحل المطلوبة لعدد من يزرع الألياف التي يجري إجراؤها، بالإضافة إلى ما يقرب من 30 في المئة اضافية لاستيعاب الخسائر الناجمة عن انسداد الماصات. المقبل، جبل حامل فيرول في جهاز ستيريويكسيكس مجهزة بضجين صغير. ضع حامل الزفير فوق المُقَدِر وتطبيق خليط الحرير/AAV من الأسفل.مناورة ماصة الحقن حتى يتم لمس أو لمس ما يقرب من مركز سطح الألياف البصرية، وإخراج 10 إلى 20 نانولترات من حل الحرير / AAV. ثم، سحب الماصة. بعد ذلك ، لاحظ بوليوس الحرير / AAV على السطح المسطح الذي يظهر كقبة سائلة تجف على فيلم مسطح في غضون دقيقة واحدة تقريبًا.كرر الخطوات السابقة حتى يتم إيداع المبلغ المطلوب من الحرير / AAV. عند إعداد غرسات متعددة، ضعي محلول الحرير/AAV على غرسة واحدة ثم انتقل إلى معطف الغرسات الأخرى، قبل العودة إلى الأولى. بعد ساعة واحدة من التجفيف، ضع حامل النهمة بأكمله في غرفة فراغ وفراغ جفاف بين عشية وضحاها في حوالي 125 تور وأربع درجات مئوية.في اليوم التالي، قم بتقييم شكل ومكانة فيلم الحرير الناتج تحت مجهر عالي الطاقة. تأكد من أن الأفلام محصورة في طرف سطح الألياف البصرية، رقيقة نسبيا، ومتناظرة. للطلاء مدبب الألياف البصرية، ضع ماصة حقن الحرير/AAV ضد جانب الألياف البصرية في بداية التفتق، والتأكد من أن الماصات لمس الألياف البصرية.Eject 20 نانويت من الحرير / AAV لبدء عملية الطلاء، وضمان أن القطرة تلتزم الألياف البصرية وتبقى في واجهة الألياف والماصات. بلطف الفتيل قطرات نحو نهاية تلميح الألياف كما يجف الحرير / AAV، والحفاظ على ماصة الحقن في اتصال مع قطرات التجفيف لتجنب انسداد تلميح ماصة. عندما قد جفت البلوس الأول تماما تقريبا، وطرد آخر 20 نانويلتر ومواصلة فتل قطرة على طول تفتق.كرر الخطوة السابقة عن طريق إخراج كميات صغيرة من الحرير / AAV ، وتجفيف الحل تدريجيا حتى جانب التفتق. بعد التجفيف، تقييم شكل وموقف من فيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة. لطلاء عدسة GRIN يزرع، إيداع الحرير / AAV في حقنة واحدة على زرع عدسة GRIN.بعد التجفيف، قم بتقييم شكل وضعية فيلم الحرير الناتج تحت مجهر عالي الطاقة لضمان أن يغطي الفيلم سطح العدسة. لطلاء الزجاج القحفية النوافذ، اليد ماصة قطرة خمسة ميكرولتر من الحرير / AAV على سطح زلة غلاف جولة ثلاثة ملليمتر بحيث تنتشر قطرات خارج لتغطية سطح الزجاج بأكمله. بعد التجفيف، قم بتخزين الألياف البصرية المغلفة بالحرير/AAV في جهاز تجفيف فراغي مبرد عند 125 تور وأربع درجات مئوية قبل زرع الأجهزة.قدمت صور الفلوريسنس للبروتينات البصرية الموسومة بالفلوروهور مقياسًا لمدى التعبير عن أفلام الحرير / AAV ، ويمكن للألياف البصرية النموذجية استيعاب 200 نانويلتر من الحرير / AAV بسهولة. مع الممارسة، يمكن للمجربين تحقيق تعبير موثوق به للغاية حول غيض من الألياف المزروعة. هناك مسألتان محتملتان مع النوافذ القحفية المغلفة هما التعبير غير الكافي، وأفلام الحرير التي تفشل في الذوبان، وتحجب مجال الرؤية.لزيادة التعبير، يمكن إجراء استئصال الزجري قبل زرع النافذة، و/ أو زيادة كمية الفيروس في الفيلم. تم تحقيق أفضل تعبير باستخدام خليط واحد إلى أربعة من الحرير والأوراق المالية AAV، على التوالي. كمية الحرير في النوافذ المطلية هي 10 إلى 100 مرة أكثر من يزرع الألياف، والفيلم هو أقل جزءا لا يتجزأ في الأنسجة، وبالتالي قد لا تتعرض لنفس مستويات النشاط البروتيوليك التي يمكن أن تذوب أفلام الحرير.ومع ذلك ، فإن وجود بعض الحرير ضروري لتحقيق التعبير الخاص بك تحت النوافذ ، على الأرجح لأن الفيلم المصنوع من الفيروس وحده يتم غسله من قبل السائل الخلالي أثناء الجراحة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم إعداد وتخزين الغرسات المغلفة بالحرير بالطريقة التي نصفها. قد يؤدي التخزين غير السليم إلى تغيير خصائص أفلام الحرير، أو تقليل فعالية متجهات التعبير الفيروسي.يمكن أن تكون هذه التقنية ذات فائدة كبيرة للباحثين في مجال علم الأعصاب في مجال الأنظمة لاستكشاف كيفية دفع النشاط العصبي للمعالجة الحسية والمعرفية في أدمغة الثدييات مثل الفئران أو الفئران أو حتى الرئيسيات غير البشرية. لا تنس أن العمل مع ناقلات التعبير الفيروسية يمكن أن تكون خطرة ومعدات الحماية الشخصية، مثل القفازات، نظارات واقية، ومعاطف المختبر، ينبغي أن ترتديه دائما أثناء العمل مع الفيروس المرتبطة أدينو.

in-vivo-targeted-expression-optogenetic-proteins-using-silkaav

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

التطور الأخير من الأدوات التي تجمع بين علم الأعصاب وعلم الوراثة وعلم البصريات، ووصف "optogenetics"، وتمكن من السيطرة على النشاط الدوائر العصبية مع مستوى غير مسبوق من القرار المكانية والزمانية. هنا نقدم بروتوكول للدمج في تسجيل المجراة مع التلاعب optogenetic من مجموعات فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية الهرمية الفص الجبهي القشرية ومرفدي.

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

يصف هذا البروتوكول الخطوات وتحليل البيانات المطلوبة لإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي البصري الوراثي (ofMRI) بنجاح. OFMRI هي تقنية جديدة تجمع بين قراءة الرنين المغناطيسي الوظيفي عالي المجال والتحفيز البصري الوراثي ، مما يسمح برسم خرائط خاصة بنوع الخلية للدوائر العصبية الوظيفية وديناميكياتها عبر الدماغ الحي بأكمله.

التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي علم البصريات الوراثي

هنا، نقوم بإظهار الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) من النواقل الفيروسية في القشرة كنهج فعال ومبسط لتحقيق التعبير البصري الجيني عبر المناطق القشرية الكبيرة في الدماغ macaque.

الحمل الحراري تعزيز التسليم من ناقلات الفيروسية المرتبطة الغدينو البصريات إلى قشرة ريسوس Macaque تحت توجيه الصور بالرنين المغناطيسي على الانترنت

يوضح البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتتبع إسقاطات الغلوتامات للمنطقة البطنية (VTA) إلى قرن آمون. تم الجمع بين التحفيز الضوئي للخلايا العصبية الغلوتامات VTA مع تسجيل CA1 لإظهار كيفية محطات الغلوتامات VTA تعدل CA1 معدل إطلاق الهرمي المفترض في الجسم الحي.

مجتمعة في فيفو التشريحية والوظيفية تتبع من محطات الغلوتامات منطقة البطن في قرن آمون

هنا ، نقدم طريقة للتحقيق في مورفوجينيا العصب في شبكية العين بعد الولادة بواسطة المجهر البؤري بفاصل زمني. نحن نصف نهجا لوضع العلامات المتناثرة واكتساب أنواع خلايا الشبكية وعملياتها الدقيقة باستخدام ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre.

التصوير بالفاصل الزمني للتشجير العصبي باستخدام وضع العلامات على الفيروسات المرتبطة بالأدينو المتناثرة لمجموعات خلايا الشبكية المستهدفة وراثيا

وكما هو مطبق حاليا، فإن علم البصريات الوراثي في الرئيسيات غير البشرية يتطلب حقن النواقل الفيروسية في الدماغ. يجب أن تكون طريقة الحقن المثلى موثوقة ، وبالنسبة للعديد من التطبيقات ، قادرة على استهداف المواقع الفردية ذات العمق التعسفي التي يتم تحديدها بسهولة وبشكل لا لبس فيه في علم الأنسجة بعد الوفاة. يتم تقديم طريقة حقن مع هذه الخصائص.

حقن ناقلات AAV لعلم البصريات الوراثي في الدماغ الرئيسيات غير البشرية المخدر والمستيقظ

يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل محسن عابر جديد قائم على rAAV. يمكن استخدام هذا الفحص للحث على التعبير المدفوع بالمحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر.

نشر AAV لبنيات التعبير القائمة على المحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر

يمكن تسخير الضوء الحيوي المنبعث من إنزيم لوسيفيراز المؤكسد لركيزة جزيء صغير ، لوسيفيرين - لتنشيط البروتينات الحسية الضوئية ، وبالتالي إضافة بعد آخر إلى تحفيز الضوء وتمكين التلاعب بالعديد من الوظائف بوساطة الضوء في الخلايا عبر المقاييس الزمنية والمكانية.

علم البصريات الحيوي 2.0: تسخير التلألؤ الحيوي لتنشيط البروتينات الحسية الضوئية في المختبر وفي الجسم الحي

نقدم هنا بروتوكولا يصف النقل الفيروسي لمناطق الدماغ المنفصلة ذات التركيبات البصرية الجينية للسماح بالتوصيف الكهروفسيولوجي الخاص بالمشابك العصبية في شرائح دماغ القوارض الحادة.

السابقين فيفو الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية

الحقن تحت الشبكية هي تقنية لا غنى عنها للتطوير قبل السريري للعلاجات لأمراض المستقبلات الضوئية وRPE. نصف تقنية حقن تحت الشبكية المحسنة عبر الصلبة في الفئران تعمل على تحسين معدلات النجاح أثناء الجراحة وتقليل تلف الشبكية.

تقنية الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة طفيفة التوغل في الفأر

اكتشف طريقة توصيل البروتينات الأوبتوجينيتيكية المستهدفة إلى مناطق الدماغ باستخدام أفلام الحرير/AAV. تُبسّط هذه التقنية عملية زرع الفيروسات وتُحسّن دقة التدخلات العصبية في دراسات علوم الأعصاب.

في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

استكشف المزيد من الفيديوهات