Name: استخدام مايديس Ustilago كحصان طروادة إيصال بروتينات الذرة في الموقع (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: اكتشف طريقة الحصان الطروادة لإيصال البروتينات في الذرة باستخدام Ustilago maydis. تتيح هذه التقنية دراسة وظائف البروتينات في الأوراق والسنابل والآذان بدقة زمانية ومكانية عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب يود أن يشكر هيلدبراند أرمين ونور الدين ديلا، توماس دريسيلهاوس ومارتن بارنيسكي لتوفير مواد المختبر الفضائي ومحطة. كان يدعمها العمل الأصلي على طريقة حصان طروادة زمالة بوستدوك ليوبولدينا وجبهة الخلاص الوطني المشروع IOS13-39229. وأيد SFB924 (مشاريع A14 و B14) من DFG العمل المعروضة في هذه المقالة.

1-بناء حصان طروادة مايديس u.
ملاحظة: انظر الشكل 1.
<ol><li>تضخيم جين للفائدة من الذرة كدنا استخدام الإشعال الخاصة بالجينات وتصحيح التجارب المطبعية بوليميريز الحمض النووي. استنساخ المنتج بكر الأولية وتحويل بنية كولاي اتباع الإرشادات الخاصة بالمورد بلازميد. تحقق من الجين الصحيح لتسلسل الفائدة سانغر التسلسل قبل استخدامها لاستنساخ الخطوات المقبلة. ملاحظة: مواصفات بكر تحتاج إلى أن يكون الأمثل نظراً لخصوصيات تسلسل التمهيدي وشروط الرد الأمثل دنا بوليميريز.</li>
	<li>تصميم كبسولة تفجير لتضخيم الجين الذرة من الفائدة دون تسلسل الترميز إشارة هضميد (SP).</li>
	<li>تمديد نهاية 5´ التمهيدي عكسي مع فكرة رسياتا و ضابط صفأنا قطع الموقع (الجدول 1).</li>
	<li>تضخيم الجين الذرة للفائدة مع بوليميريز الحمض النووي تصحيح التجارب المطبعية استخدام بنية بكر ولدت في 1.1 كقالب PCR.</li>
	<li>مزدوج-خلاصة المنتج بكر وبلازميد التحول U. مايديس ، p123-سأمpit2-سأمpit2-Zmmac1-مشري-ها15، مع إكسباو ضابط صف أولاً تنقية المنتج بكر وبلازميد هضمها.</li>
	<li>اضطر المنتج بكر هضمها في p123-سأمpit2-سأمpit2-Zmmac1-مشري-ها القالب باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى اتباع التعليمات manufacturer´s. تحويل المنتج ربط كولاي والتحقق من الجين الصحيح لتسلسل الاهتمام سانغر التسلسل.</li>
	<li>لينيريزي p123-سأمpit2-سأمpit2-Zmالجينات للفائدة-مشري-ها مع إنزيم التقييد Sspالأول وتحويل الحمض النووي في الولايات المتحدة سولوباثوجينيك مايديس سلالة SG20016. عزل ترانسفورمانتس مايديس الولايات المتحدة بالتحديد كاربوكسين وتأكيد ترانسفورمانتس معزولة بالجنوب لطخة تحليل16. ملاحظة: لكل البروتين من الفائدة، مستقلة على الأقل ثلاثة مايديس U. ترانسفورمانتس ينبغي أن تكون معزولة وتحليلها لتقدير آثار النمط الظاهري أي خلفية عشوائية الطفرات.</li>
</ol>2-ثقافة وسائل الإعلام
<ol><li>إعداد ييبسلايت السائلة متوسطة16: استخراج الخميرة 1.0% (w/v)، 0.4% (w/v) باكتو-ببتون، والسكروز 0.4% (w/v). تذوب جميع المكونات في ddH2س والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ التعقيم في درجة حرارة أعلى، لفترة أطول من الوقت أو بصورة متكررة وسوف يقلل من جودة المتوسطة.</li>
	<li>إعداد البطاطا-سكر العنب-أجار (PD-أجار)20: أجار سكر العنب البطاطا 3.9% (w/v)، و 1.0% (w/v) 1 م تريس-HCl pH 8.0 (نادي 0.01 M). مزيج جميع المكونات في الزجاجة للتعقيم مباشرة وإضافة ddH2س بالإضافة إلى حانة إثارة مغناطيسية. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ التعقيم في درجة حرارة أعلى، لفترة أطول من الوقت أو بصورة متكررة وسوف يقلل من جودة المتوسطة.</li>
	<li>إعداد PD-الفحم أجار20: 3.9% (w/v) البطاطا الدكستروز أجار والفحم 1% (w/v) 1.0% (v/v) 1 م تريس-HCl pH 8.0 (نادي 0.01 M). مزيج جميع المكونات في الزجاجة للتعقيم مباشرة وإضافة ddH2س بالإضافة إلى حانة إثارة مغناطيسية. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ التعقيم في درجة حرارة أعلى، لفترة أطول من الوقت أو بصورة متكررة وسوف يقلل من جودة المتوسطة.</li>
</ol>3-مصنع العدوى
<ol><li>إجراء تحليل لانقسام الخلية الذرة ردا على حصان طروادة تسليم البروتين (مثلاً، على أساس الفحص المجهري خلية العد) مسبقاً. U. مايديسالناجمة عن انتشار الخلايا الذرة ويبدأ تشكيل الورم اللاحقة حول 4-5 أيام بعد الإصابة. التقييمات الكمية المرض تعتمد على الأنسجة، وينبغي أن يتم من 6 إلى 14 يوما بعد الإصابة. ملاحظة: أصناف الذرة متميزة تظهر مستويات مختلفة من التعرض للإصابة مايديس U. . الذرة جمقابل W23، A188، جاسب فلينت، أوائل الذهبي البنطم أو Va35 تظهر حساسية تجاه هذا الممرض وبالتالي فهي أصناف مناسبة للدراسات حصان طروادة.</li>
	<li>إعداد العدوى مايديس u.
	<ol>
<li>وتشمل سلالة السلف SG200 كعنصر سلبي في كل حصان طروادة التجارب بغية تقدير الآثار الجانبية على العدوى بسلالة محوره وراثيا. هنا، استخدم سلالة مايديس الولايات المتحدة الإعراب عن نسخة غير يفرز البروتين من الفائدة كعنصر سلبي. ومع ذلك، لأسباب تتعلق بالطابع العملي (مثلاً، أكبر عروض)، سلالة السلف قد يكون الاختيار أسهل من التحكم.</li>
		<li>قبل البدء التجربة، تقدير ما كميات من عدوى الثقافة مطلوبة. نضع في اعتبارنا أن العدوى لكل مصنع يتطلب 1-1.5 مل تعليق مايديس الولايات المتحدة تعتمد على نوع النسيج الذرة. ملاحظة: حوالي 1 مل ثقافة بين عشية وضحاها كافية لتمييع ل التطوير التنظيمي600 مل 0.2 في 20 من ييبسخفيفة متوسطة، ومل 25 ثقافة مايديس الولايات المتحدة مع OD600 من 0.8-1.0 كافية لعدوى نباتات 13-16.</li>
		<li>الصفر مايديس U. من أجار PD لوحة باستخدام ماصة باستور معقمة وتطعيم في 5 مل من ييبسخفيفة متوسطة واسمحوا ثقافة تنمو في 28 درجة مئوية مع الهز المستمر في 200 لفة في الدقيقة ح 16.</li>
		<li>قبل الإصابة، دراسة ثقافة التطعيم مايديس شين بالفحص المجهري الخفيفة القياسية للنمو السليم والتلوث البكتيري في 400 X التكبير. ملاحظة: في ثقافة مناسبة، وهو فقط على شكل السيجار الفطر مرئية (الشكل 2).</li>
		<li>مزيج ميليلتر 900 من جديد ييبسالضوء مع 100 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها، وقياس OD600 استخدام ييبسخفيفة متوسطة كقرص فارغ في تحليل جهاز المطياف الضوئي.</li>
		<li>تمييع الثقافة بين عشية وضحاها مع ييبسخفيفة متوسطة جديدة ل التطوير التنظيمي600 من 0.2 وترك ثقافة تنمو في 28 درجة مئوية مع الهز المستمر 200 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى مرحلة النمو سجل منتصف المؤشرة التطوير التنظيمي600 نانومتر 0.8-1.0. ملاحظة: U. مايديس الخلايا تكرار كل ح 2 في ظل هذه الظروف، وبالتالي التوصل إلى التطوير التنظيمي المطلوب600 بعد ح 4-5 من زراعة.</li>
		<li>حصاد الخلايا OD600 من 0.8-1.0 بالغزل في 3,000 س ز لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية.</li>
		<li>أغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع ddH2o. لهذا الغرض، إضافة إلى حجم ثقافة واحدة من ddH2س، تدور مع 3000 x ز لمدة 10 دقائق وتجاهل المادة طافية.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية بعناية في ddH2س باستخدام ماصة زجاجية 20 مل، وبالتالي ضبط التطوير التنظيمي النهائي600 إلى 3.0 (بالنسبة مقايسة حصان طروادة) أو 1.0 (لتصنيف الأمراض).</li>
	</ol></li>
	<li>تحقق حصان طروادة: في إفراز بﻻنتا من البروتين الانصهار الذرة
	<ol>
<li>إصابة بذور الذرة مع سلالة حصان طروادة17.</li>
		<li>القيام بتصوير مجهرية من الشتلات المصابة في 2-3 أيام بعد العدوى باستخدام مجهر مسح ليزر [كنفوكل]. وتحقيقا لهذه الغاية، المكوس قطعة مستطيلة من ورقة 1 سم أسفل نقطة الحقن ووضع العينة على شريحة مجهر وإضافة قطره من ddH2o. أن تصور البروتينات الانصهار مشري، تثير عينة في λ = 561 نيوتن متر وسجل الانبعاثات في λ = 580-630 نيوتن متر.</li>
	</ol></li>
	<li>يترك عدوى ذرة الكبار
	<ol>
<li>زراعة نباتات الذرة إلى مرحلة يترك الكبار (عندما يقل نبات ينمو 7 داخل الساق). ملاحظة: يتم الوصول إلى هذه المرحلة بعد أربعة أسابيع عند البذر تحت ظروف الاحتباس الحراري ح 14، 28 درجة مئوية اليوم/10 ح، وإيقاع ليلة 22 درجة مئوية باستخدام عام W23. قد تختلف المدة مع شروط الذرة الصنف والاحتباس الحراري.</li>
		<li>نقل ثقافة مايديس U. (انظر 3.2.9) في محقن 3 مل مع إبرة حقن 20 × 1.</li>
		<li>اضغط ساق بعناية لتعريب الأنسجة أرض في الساق. ويمكن تمييز قاعدة أرض بانتقال من ساق أكثر صعوبة للأنسجة ليونة.</li>
		<li>وضع علامة أرض على ساق استخدام قلم.</li>
		<li>حقن 1.5 مل مايديس U. الثقافة 1 سم فوق أرض تبادل لإطلاق النار أو أرض نورات.</li>
		<li>معدل أعراض المرض في 6 و 12 يوما بعد الإصابة.</li>
	</ol></li>
	<li>عدوى شرابات
	<ol>
<li>زراعة نباتات الذرة حتى وصلت إلى مرحلة شرابه. ملاحظة: وكان وضع جدول زمني مفصل في التنمية العضو الذكرى وشرابه في عام الذرة W23 هو موضح سابقا18،19. شرابات المحتوية على أنثيرس هو ما قبل تكون عرضه للإصابة مايديس الولايات المتحدة ؛ في عام الذرة W23 شرابات بحجم 4-7 سم.</li>
		<li>اضغط على ساق بعناية لتعريب الشرابة في الساق.</li>
		<li>وضع علامة على الحافة وقاعدة الشرابة على وقف استخدام قلم.</li>
		<li>نقل ثقافة مايديس U. (انظر 3.2.9) في محقن 3 مل مع إبرة حقن 20 × 1.</li>
		<li>حقن 1.5 مل العدوى حولها الشرابة. لضمان التوزيع المتساوي للعدوى، ببطء مكان كل 0.5 مل على الحافة والجزء الأوسط والقاعدة من شرابه تم وضع علامة بالقلم.</li>
		<li>معدل أعراض المرض في 10 أيام بعد الإصابة.</li>
	</ol></li>
	<li>عدوى آذان ملاحظة: تطوير أنسجة الإذن تختلف في ظروف الاحتباس الحراري وأصناف الذرة متميزة ويجب أن يراعي بدقة قبل التطعيم. آذان بدأت تتفوق الحرير عرضه للعدوى U. مايديس .<ol>
<li>نقل ثقافة مايديس U. (انظر 3.2.9) في محقن 3 مللي مع إبرة حقن 20 × 1.</li>
		<li>حقن إبرة التطعيم في المسافة بين أوراق قشر عميق قدر الإمكان دون إصابة الإذن.</li>
		<li>الإصدار 1.5 مل العدوى حول الإذن.</li>
		<li>إزالة حقنه بالإضافة إلى الإبر والتدليك بعناية الكوز لتوزيع حل مايديس الولايات المتحدة على قدم المساواة.</li>
		<li>معدل أعراض المرض في 14 يوما بعد الإصابة.</li>
	</ol></li>
	<li>التأكد من صلاحية العدوى مايديس u.
	<ol>
<li>إسقاط 10 ميليلتر من العدوى على طبق أجار فحم PD واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين. ملاحظة: إذا كان كل ثقافة مايديس الولايات المتحدة غير قادرة على شكل خيوط، الميسليوم الأبيض رقيق، وتصبح مرئية (الشكل 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+tumour%3A+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+a+maize+plant%3A+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep1%2C+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.%2C+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).</li>
<li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li>
<li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355(2014).</li>
<li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).</li>
<li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li>
<li>Juárez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut+%28%27Huitlacoche%27%29+as+a+new+platform+for+oral+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535(2015).</li>
<li>Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarkari%2C+P+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).</li>
<li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+%28Zea+mays%29+anther+cell+behavior+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li>
<li>Bösch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li>
<li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li>
<li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Maydica%22%5BJournal%5D)">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34(2015).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Bacteria%2C+Bacteriophages%2C+and+Fungi%3A+Volume+1%22">Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1</a>. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).</li>
<li>Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li>
<li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li>
<li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

بحوث المحاصيل الحديثة تتطلب البروتوكولات للتحليل الجزيئي في الجينية ومستويات البروتين. الوصول الوراثية عن طريق التحول غير متاح أو غير فعال وتستغرق وقتاً طويلاً لمعظم أنواع المحاصيل مثل الذرة. وعلاوة على ذلك، الأدوات الوراثية الموثوقة، مثل نظم مراسل المروج نادرة، مما يجعل من الصعب على دراسة وظيفة البروتين في الموقع مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية في مواقع متميزة من الأنسجة. يمكن دراسة البروتينات أبوبلاستيك بتسلل هيتيرولوجوسلي المعلنة وتنقية البروتينات داخل الأنسجة. على الرغم من أوجه التقدم في تعبير مغايرة من ا...

الممرض بيوتروفيك مايديس Ustilago هو المسبّب ل مرض التفحم الذرة1. أنه يصيب جميع أجزاء الجوي من الذرة الناتج في الأورام الكبيرة التي تحتوي على جراثيم ميلانيزيد، أسود. على الصعيد العالمي، يقدر مايديس U. يسبب خسارة سنوية من حوالي 2 في المائة محصول الذرة، بينما تقدر الأورام كطعام شهي تذوقي في المكسيك. مصنع العدوى هو بدأها أبريسوريوم التي تفرز الإنزيمات ليسينج جدار الخلية لاختراق الطبقة الأولى من خلايا البشرة الذرة. من موقع إصابة الأولية، ينمو مايديس U. إينتراسيلولارلي وإينتيرسيلولارلي، وغزو الخلية واحد إلى اثنين طبقات كل يوم1،2. نتائج الإصابة بنجاح في تضخم النباتات التي تتحول إلى أورام مرئية إلى خمسة أيام بعد الإصابة1،،من34. خلال جميع مراحل العدوى، إينفاجيناتي الفطرية خيوط فطرية الغشاء الهيولى المصنع دون أي اتصال مباشر إلى1،السيتوبلازم المضيف2. أبوبلاسميك ضيق المساحة بين خيوط فطرية إصابة وغشاء البلازما النبات يعتبر الموقع المضيف/الممرض التفاعلية، وتسمى منطقة التفاعل بيوتروفيك. وللتغلب على نظام المناعة الفطرية النباتية، تفرز U. مايديس صفيف بروتينات المستجيب في منطقة التفاعل بيوتروفيك1. وتتخذ بعض المستجيبة بالخلايا النباتية، بينما البعض الآخر لا يزال في بيوتروفيك تفاعل المنطقة5،6،،من78. واحد أبوبلاستيك المستجيب هو UmPit2، الذي يتفاعل مع البروتياز أبوبلاستيك الذرة لمنع الإفراج عن الببتيد ZmZIP1 من زمبروزيب،أبوبلاستيك البروتياز النشاط9مما يشير إلى10.
على مدى العقود الماضية، U. مايديس أصبح ليس إلا نموذجا لعلم الوراثة الفطرية في تفاعل الكائنات الممرضة النباتية، ولكن أيضا أداة قيمة في مجال التكنولوجيا الأحيائية بسبب دورة الحياة مفهومة جيدا، سهولة الوراثية وتعبير مغايرة يفرز البروتينات11،،من1213. إشارات لإفراز البروتين التقليدية وغير التقليدية على حد سواء قد تم تحديد السماح بالتحكم في تعديلات بوستترانسلاشونال14. في الآونة الأخيرة، استخدمت U. مايديس كأداة حصان طروادة لدراسة صغيرة، ويفرز البروتينات الذرة في الموقع15. النهج حصان طروادة الذي استخدمت بنجاح لتحليل وظيفة البروتين الصغيرة، ويفرز ZmMAC1 التي تشارك في وضع العضو الذكرى. ZmMAC1 يدفع شعبة بيريكلينال pluripotent الخلايا ومواصفات مصير خلية من خلايا المنشأ حديثا15. بنفس الطريقة، كشف عن الوظيفة البيولوجية للذرة الببتيد المرتبط بالضرر ZmZIP1. مايديس U. إفراز الذرة ZmZIP1 أدت إلى إعاقة الورم تشكيل10. وهكذا، تمثل النهج حصان طروادة طريقا بديلة قيماً للبروتين في دراسات الموقع مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية التي لا لا تتطلب توليد خطوط تحويل الذرة مستقرة ولا تسلل الأنسجة مع هيتيرولوجوسلي أعرب عنه وتنقية البروتينات. على وجه الخصوص، استراتيجية حصان طروادة يتيح إفراز أي البروتين مغايرة في أبوبلاست الذرة والمقارنة المباشرة للمصابين مقابل الخلايا النباتية غير المصابة داخل النسيج نفسه.
هذا البروتوكول يوضح الخطوات الرئيسية لتوليد عبئا حصان طروادة مايديس الولايات المتحدة لدراسة وتين فائدة. كذلك يتضمن معلومات دقيقة عن إجراءات العدوى من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة (أوراق الكبار، شرابات وآذان) مع مايديس شين، الذي شرط أساسي لدراسة وظيفة البروتين وتطور الإصابة الزمانية المكانية في هذه الأنسجة المستهدفة. أي مواصفات أخرى معين على الذرة الجينات التضخيم والمجهري تقنيات، التصوير منذ هذه الخطوات محددة الهدف وتعتمد على الصك. وهكذا، هذا البروتوكول هو موجهة إلى المستخدمين ذوي الخبرة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.

<table><tbody><tr><td>2 مل حقنة&nbsp;</td><td>ب. براون</td><td>4606027 فولت</td><td></td></tr><tr><td>23 جم × 1 1/4 إبرة تحت الجلد</td><td>ب. براون</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>باكتو بيبتون&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>(كدنا) من الذرة</td><td></td><td></td><td>من أنسجة الذرة التي تعبر عن جين</td></tr><tr><td>الفحم المترابط</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>05105</td><td></td></tr><tr>يستخدم<td>مجهر</td><td></td><td></td> المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر <td>المعدات المتوفرة</td></tr><tr><td>محليا Cuvette (10 مم × 4 مم × 45 مم)</td> <td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>الحاضنة شاكر ضبط على 28 درجة ؛ C ، 200 دورة في الدقيقة</td><td></td><td></td><td>تستخدم المعدات المتاحة محليا</td></tr><tr><td>المجهر الخفيف مع تكبير</td><td></td><td></td> 400 ضعف <td>استخدام المعدات المتاحة</td></tr> <tr><td>محلياNco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td> <td>يرجى الاتصال بالمؤلف المراسل &nbsp ؛</td></tr>يمكن استبدال <tr><td>ماصة باستور (زجاج ، طرف طويل)</td> <td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>K280002 بناقلات الاستنساخ الأساسية الأخرى مثل pENTR أو pJET</td></tr><tr><td>Potato Dextrose Agar &nbsp ؛</td><td>يستخدم قلم</td><td></td> VWR 90000-745 <td></td></tr><tr><td>Sharpie</td><td>المعدات المتاحة محليا</td>يستخدم مقياس الطيف الضوئي المعدات المتاحة محليا SSP < م > I NEB R0132 السكروز سيجما ألدريتش S0389 T4 DNA ligase NEB M0202 TRIS <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>سيجما ألدريتش</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>em>Xba أنا</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>مستخلص الخميرة&nbsp;</td><td>212750</td><td></td> <td>د.ب</td></tr></tbody></table>

استخدام مايديس ustilago كحصان طروادة "إيصال بروتينات الذرة في الموقع"

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

مستوحاة من أسطورة حصان طروادة Homer´s، نحن هندسيا الممرض مايديس Ustilago توصيل البروتينات يفرزها إلى أبوبلاست الذرة التي تسمح بتحليل المظهرية المجراة في الذرة. هذا الأسلوب لا يعتمد على تحويل الذرة ولكن يستغل قدرات الافرازية من مسببات الأمراض وعلم الوراثة الميكروبية. هذه الوثيقة، فإنه يسمح تفتيش المجراة في تسليم البروتينات يفرزها مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية في أنواع مختلفة من مواقع الإصابة والأنسجة. يمكن استخدامها لعابر يكمل الذرة خسارة للدالة تعمل، لتوصيف وظيفيا نطاقات البروتين، لتحليل آثار البروتين خارج الهدف، أو لدراسة البروتين هدوئي الجرعة الزائدة، مما يجعله أداة قوية لاستراتيجية حصان طروادة دراسات البروتين في النظام محصول الذرة. ويتضمن هذا العمل بروتوكول دقيق بشأن كيفية توليد سلالة حصان طروادة تليها البروتوكولات العدوى موحدة لتطبيق هذا الأسلوب على ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.

يتم استنساخ بنيات لإجراء التجارب على حصان طروادة U. مايديس إلى بلازميد ف p123أمpit2-سأمpit2-الجينات للاهتمام--متشيري--هكتار. الجين الذرة للفائدة هو تنصهر فيها مراسل مشري fluorescence وبيفرتون ها--الوسم. يتم التعبير عن البروتين الانصهار تحت سيطرة المروج مايديس الولايات المتحدة Umpit2 الذي يتم تنشيطه على وجه التحديد أثناء العدوى21. لإف...

ويصف هذا العمل استنساخ عبئا مايديس Ustilago حصان طروادة لإيصال بروتينات الذرة يفرز في الموقع إلى ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.

استخدام مايديس Ustilago كحصان طروادة "إيصال بروتينات الذرة في الموقع"

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

إنّ تحري العمليات على مستويات الجينات والبروتينات أمر بالغ الأهمية في بحوث المحاصيل. نهجنا تمكن من فحص البروتينات المتاهة المفرزة مع أعلى دقة الزمانية المكانية في مختلف جوانب العدوى والأنسجة. تستكشف طريقة حصان طروادة قدرات إفرازية تلقائية مفيدة.أنه يتحايل على الوقت المستهلكة وتحدي التحولات المتاهة، ويسهل الدراسات التفصيلية على البروتينات المفرزة داخل appelplatz المتاهة. معلومات مفصلة عن العدوى السليمة من أوراق المتاهة المضافة، شرابات والأذن. ويظهر الدراسة الناجحة لتطور العدوى ووظيفة البروتين في الأنسجة المستهدفة.ومن خلال هذا الإجراء، ستكون إيزابيل فيدلر، وهي طالبة خرّج من المختبر. لبدء التجربة، خدش Eumadous من لوحة pediatr باستخدام ماصة معجنات معقمة. تلقيح 5 ملليلتر من المتوسط الخفيف YEPS مع Eumadous.تنمو الثقافة في 28 درجة مئوية، مع اهتزاز مستمر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي مزيج 900 ميكرولترات من ضوء YEPS الطازجة مع 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها. قياس OD-600 باستخدام ضوء متوسطة YEPS كفراغ في تحليل مقياس الطيف.تمييع ثقافة بين عشية وضحاها مع ضوء YEPS جديدة المتوسطة إلى OD-600 من 2. اسمحوا ثقافة تنمو في 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر في 200 دورة في الدقيقة، حتى تصل إلى منتصف مرحلة النمو سجل، المشار إليها من قبل OD-600 من 8 إلى 1.0. بعد الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق الغزل لهم في 3000 مرات تشي لمدة 10 دقائق.تجاهل المُندفع. بعد ذلك ، قم بغسل كومة الخلية مرة واحدة مع حجم ثقافة 1 من DDH2O. تدور الخلايا في 3000 وقت تشي لمدة 10 دقائق وتجاهل افر.ثم, إعادة تعليق كومة الخلية بعناية في DDH2O, باستخدام ماصة زجاجية 20 ملليلتر. وبالتالي تعديل النهائي OD-600 إلى 3.0 لم مقايسة حصان طروادة أو 1.0 لتصنيف المرض. زراعة النباتات المتاهة إلى مرحلة من أوراق الكبار، حيث على الأقل ورقة 7 ينمو داخل ساق.بعد ذلك، نقل الثقافة Eumadous إلى حقنة 3 ملليلتر مع 20 قياس ثنائية واحد إبرة تحت الجلد. اضغط على ساق بعناية لتوطين الأنسجة الجذعية مرآة. يمكن تمييز قاعدة جذع المرآة بالانتقال من ساق أصعب إلى أنسجة أكثر ليونة.وضع علامة على جذع المرآة على الساق باستخدام القلم. حقن 1.5 ملليلتر من الثقافة Eumadous 1 سنتيمتر فوق الجذعية تبادل لاطلاق النار مرآة أو استنفرس مرآة الجذعية. بمجرد أن تصل نباتات المتاهة إلى مرحلة شرابة ، اضغط على الساق بعناية لتوطين شرابة في الساق.وضع علامة على طرف وقاعدة شرابة على الجذعية باستخدام القلم. نقل الثقافة Eumadous في حقنة 3 ملليلتر مع 20 قياس ثنائية واحد هدمة حقن ما مجموعه 1.5 ملليلتر من inoculum حول شرابة. لضمان التوزيع المتساوي للـ inoculum، ضع ببطء 5 ملليلترات في الطرف، الأوسط، وقاعدة شرابة مع علامة القلم.نقل الثقافة Eumadous في حقنة 3 ملليلتر مع 20 قياس ثنائية واحد إبرة تحت الجلد. حقن إبرة التلقيح في الفضاء بين أوراق قشر أعمق قدر الإمكان دون إصابة الأذن، ثم الافراج عن 1.5 ملليلتر من inoculum حول الأذن. بعد ذلك، قم بإزالة الحقنة والإبرة وتدليك الكوز بعناية لتوزيع محلول Eumadous بالتساوي.إسقاط 10 ميكرولتر من inoculum على لوحة الفحم PD أوجير. ثم احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 أيام. هيفا يفرز ZM Mach1 محاطة الفلورسنت وإشارة الكرز.في المقابل، لا تظهر الهزيمة غيرsecreting سوى إشارة الفلورسنت في السيتوبلازم الفطري. غير لائق تعريب شرابة أو توزيع غير متساو من inoculum يمكن أن يؤدي إلى شرابة غير المصابة أو عدوى جزئية فقط من شرابة مقارنة حتى التوزيع. منفردا المسببة للأمراض حصان طروادة سلالة SG-200، مثقف على أوجير الفحم PD، يشكل خيوط زغب أبيض على لوحة كما هو مبين.في حين أن سلالة Eumadous FB1 يتطلب التزاوج قبل تشكيل خيوط المعدية. بعد العدوى، يمكن تحليل الاستجابة المحتملة للعلامات بروتين الكبد حصان طروادة باستخدام طرق مختلفة بما في ذلك تقييمات المرض أو التصوير المجهري. بالنسبة للعديد من مسببات الأمراض ، فإن التحول والإفراز مفهومان جيدًا ويمكن استكشافهما بطريقة مماثلة.ولذلك، فإنها تمكن دراسة المضيف، والتي ليست عرضة للتحول.

using-ustilago-maydis-as-trojan-horse-for-situ-delivery-maize

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

المصدر: بيرنينك، ب. م. وآخرون. التلقيح المباشر لشتلات الذرة عن طريق الحقن بفيروس فسيفساء ذيل الثعلب المؤتلف وفيروس فسيفساء قصب السكر المستنسخ المعدية. J. Vis. Exp. (2021)يوضح هذا الفيديو توصيل النسخ الفيروسية المؤتليفة بواسطة الزراعة البكتيريا إلى شتلات الذرة لإسكات الجينات. يوضح عملية عدوى البكتيريا الزراعية ، وانتشار الفيروسات الجهازية، والتغيرات الظاهرية الناتجة عن تداخل الحمض النووي الريبي.

توصيل النسخ الفيروسية المؤتلفة بواسطة الزراعة الكيميائية إلى شتلات الذرة لإسكات الجينات

يوصف استخدام طريقة حقن الإبر لتطعيم الذرة ونباتات التيوسينت مع مسببات الأمراض النيروبية الحيوية أوستيلاغو مايديس.  تسهل طريقة تلقيح حقن الإبر التسليم المراقب لمسببات الأمراض الفطرية بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل الأبريسوريا. هذه الطريقة هي فعالة للغاية، وتمكين التلقيح القابلة للاستنساخ مع U. maydis.

طريقة سريعة وفعالة لتقييم الإمراض في أوستيلاغو مايديس على خطوط الذرة والتيوسينت

نحن تصف استراتيجية استبدال الجينات قوية لمعالجة وراثيا فطر التفحم السوادية الذروية. يشرح هذا البروتوكول كيفية توليد المسوخ الحذف للتحقيق في الظواهر العدوى. ويمكن أن تمتد إلى تعديل الجينات بأي شكل من الأشكال المطلوبة، على سبيل المثال، عن طريق إضافة تسلسل ترميز علامة بروتين فلوري.

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

نقدم هنا بروتوكولا لتحليل نمو رشاشيه الخنزير وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات الذرة معربا عن البروتينات المضادة للفطور.  استخدام سلالة الإعراب عن التجارة والنقل (أ) الخنزير نحن رصد العدوى وانتشار الفطريات في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي. المقايسة سريعة وموثوق بها، واستنساخه.

تثبيط النمو رشاشيه الخنزير و "إنتاج الأفلاتوكسين" في "الإعراب عن الذرة المعدلة وراثيا" المانع α-الأميليز من purpureus لابلاب ل.

يمكن استخدام الجينات المورجينية النباتية لتحسين التحول الوراثي للأنماط الجينية المتمردة. وصف هنا هو بروتوكول التحول الوراثي بوساطة Agrobacterium(QuickCorn) لثلاثة خطوط ذرة عامة هامة أصيلة.

البكتريا الزراعية-بوساطة تحويل الجنين غير الناضج من خطوط الذرة المستعبدة المستنعين باستخدام الجينات المورجينية

يتم تقديم بروتوكول الحقن القائم على Agrobacterium (الحقن الزراعي) لتلقيح فيروس فسيفساء ذيل الثعلب وفيروسات فسيفساء قصب السكر المستنسخة في شتلات الذرة. يؤدي التلقيح بهذه الطريقة إلى العدوى الفيروسية ، وإسكات الجينات التي يسببها الفيروس للجينات الواسمة ، والإفراط في التعبير الفيروسي عن GFP.

التلقيح الزراعي المباشر لشتلات الذرة عن طريق الحقن مع فيروس فسيفساء ذيل الثعلب المؤتلف وفيروس فسيفساء قصب السكر المستنسخات المعدية

هنا ، نقدم بروتوكولا عالي الإنتاجية لنقل ملايين بروتوبلاستات الذرة بشكل عابر لاختبار مكتبات كبيرة من البلازميدات في خلايا ميزوفيل الذرة.

قابلية النقل القابلة للتطوير لبروتوبلاستات ميزوفيل الذرة

تسلسل وحيد الخلية هو أداة شعبية متزايدة ويمكن الوصول إليها لمعالجة التغيرات الجينية بدقة عالية. ونحن نقدم البروتوكول الذي يستخدم التسلسل خلية واحدة لتحديد عدد النسخ تغييرات في الخلايا وحيدة.

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

يتم تقديم استراتيجية لتوليد طفرات في جينات الهيستون في موقعها الداخلي في خميرة الخميرة.

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

هنا يصف لنا إيصال ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف فيروسات المرتبطة بالغدة 9 في نموذج الفأر الأمراض العصبية العضلية. إدارة واحدة طرفية في الفئران أسفرت overexpression ميرنا المطرد في العضلات والخلايا العصبية الحركية، مما أتاح فرصة لدراسة ميرنا الدالة والعلاجية المحتملة في فيفو.

منهجية تقديم ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة 9 لعلاج الأمراض العصبية العضلية في القوارض

اكتشف طريقة الحصان الطروادة لإيصال البروتينات في الذرة باستخدام Ustilago maydis. تتيح هذه التقنية دراسة وظائف البروتينات في الأوراق والسنابل والآذان بدقة زمانية ومكانية عالية.

استخدام مايديس Ustilago كحصان طروادة "إيصال بروتينات الذرة في الموقع"

استكشف المزيد من الفيديوهات