Name: تقييم سلامة الحمض النووي الخلايا الجذعية للعلاج بخلايا القلب (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: تعلم بروتوكولات تقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية المستحثة قبل زراعتها لعلاج أمراض القلب. تضمن هذه الطرق جودة الخلايا ونجاح العلاج التجددي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا العمل وأيده في الجزء الوطني للقلب والرئة والدم المعهد المنح RO1-HL-99507, HL-114120، HL-131017، HL138023، و UO1-HL-134764 (على تشانغ جيه)، و "جمعية القلب الأمريكية العلمية التنمية منحة" 17SDG33670677 (إلى ر. كانابان).

1-المذنب بالانزيم
<ol><li>
إعداد كاشف
	<ol>
<li>لنقطة انصهار منخفضة [اغروس]، ضع 500 ملغ من ذوبان منخفضة [اغروس] في 100 مل من الحمض النووي-/المياه خالية من الجيش الملكي النيبالي. حرارة الزجاجة في فرن ميكروويف حتى يذوب [اغروس]. ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية إلى حين الحاجة. ملاحظة: لمزيد من القراءة، انظر ازكويتا et al., الذين درسوا آثار تركيز [اغروس] في وقت الاسترخاء الحمض النووي والتفريد عدة عوامل23.</li>
		<li>تمييع صبغ الحمض النووي سيبر الخضراء في المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) بنسبة المضيفين للحصول على 1 × يعمل الحل صبغ الأسهم. هذه الصبغة حساسة للضوء، لذا قم بتخزينها في مكان مظلم.</li>
		<li>للمخزن المؤقت لتحلل الخلية، حل 100 مل من المخزن المؤقت لتحلل (2.5 م كلوريد الصوديوم، يدتا م 0.1، 10 مم تريس، 1% Triton X-100) في المياه (دي ح2س). ثم إضافة هيدروكسيد الصوديوم م 10 لضبط درجة الحموضة إلى 10.0. تبريد المخزن المؤقت إلى 4 درجات مئوية.</li>
		<li>القلوية الحمض النووي-تفكيك/التفريد تشغيل المخزن المؤقت، حل ل 1 لحل القلوية (0.3 M هيدروكسيد مايو الصوديوم، 1 مم يدتا) في ح دي2سين بارد المخزن المؤقت إلى 4 درجات مئوية. تأكد من الرقم الهيدروجيني > 13.</li>
		<li>للشرائح المذنب بريكواتيد، وضع بضع قطرات من 0.5% [اغروس] على شريحة زجاجية. استخدام سطح مستو من شريحة أخرى، انتشرت على الفور، [اغروس] تشكل طبقة رقيقة من طلاء [اغروس]. ملاحظة: الجاف للشرائح قبل استخدام.</li>
		<li>لزراعة الخلايا المتكاملة، بإيجاز خلايا iPS الثقافة في الطابق السفلي-غشاء-ماتريكس-المغلفة (انظر الجدول للمواد) ثقافة لوحات في mTESR1 الثقافة المتوسطة حتى يتم التوصل إلى كونفلوينسي. ملاحظة: واستخدمت خلايا الإنسان القلب-تنتجها الخلايا الليفية-المستمدة من البرامج المتكاملة في هذا البروتوكول. إعادة برمجة اشتقاق خلايا iPS وشروط الثقافة يرد في المقالات الأخيرة من أعمالنا البحث مجموعة12،13،21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد نموذج
	<ol>
<li>تجاهل المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا. فصل الخلايا باستخدام حل مفرزة (انظر الجدول للمواد). أغسل بيليه الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني في 1 × 105 خلايا/مل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد شرائح العينة ملاحظة: نفذ الخطوات التالية لتجنب الأضرار التي يسببها الضوء فوق البنفسجي خلية في ظروف الإضاءة المنخفضة.<ol>
<li>ميكس 10 ميكروليتر من تعليق خلية وميكروليتر 90 من حل [اغروس] (01:10 نسبة) في أنبوب. ضع الأنبوبة في حمام مائي 37 درجة مئوية للحيلولة دون ترسيخ [اغروس].</li>
		<li>مزيج الحلول دون إدخال فقاعات الهواء و "الماصة؛" 70 ميكروليتر/بقعة على شريحة المذنب بريكواتيد. استخدام تلميح ماصة، ينتشر الخليط [اغروس] خلية تشكل طبقة رقيقة. ضع الشريحة في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>في حاوية، تغرق تماما الشريحة الموجودة في المخزن المؤقت لتحلل الباردة. وضع الحاوية في الظلام في 4 درجات مئوية عن ح 1.</li>
		<li>يستعاض عن المخزن المؤقت تحلل بحل القلوية الباردة. تأكد من أن الشرائح مغمورة تماما. وضع الحاوية في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
التفريد
	<ol>
<li>ضع الشريحة في خزان التفريد أفقي. ملء الخزان بالتفريد القلوية الباردة المخزن المؤقت حتى الشرائح مغمورة تماما. تطبيق الجهد في الخامس 1/سم لمدة 15 إلى 30 دقيقة. ملاحظة: مجموع الجهد = المسافة بين أقطاب x 1 الخامس</li>
		<li>في حاوية، تغرق تماما الشريحة في البرد دي H2o. بعد 2 دقيقة، إزالة دي ح2س وإضافة جديدة دي ح2سين كرر هذه الخطوة.</li>
		<li>يستعاض عن دي ح2س بالبرد 70% إيثانول. الانتظار 5 كحد أدنى بلطف إزالة الشريحة ولا إمالة عليه وندعه أيردري.</li>
		<li>مرة واحدة المجففة، إضافة 100 ميكروليتر من صبغ الحمض المخفف لكل بقعة. الانتظار 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام عامل تصفية فيتك مجهر ابيفلوريسسينسي، التقاط صور من 50 إلى 100 المذنبات في مجموع كل عينة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
حساب للنتائج وتحليل الصور
	<ol>
<li>للتهديف المذنبات، تستخدم في "المعاهد الوطنية للصحة" في (المعاهد الوطنية للصحة) إيماجيج مع المذنب الإنزيم المساعد (تحميل إيماجيج هنا: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; تحميل البرنامج المساعد هنا: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). ملاحظة: ويأتي البرنامج المساعد مع تعليمة PDF التي تحتوي على كافة التفاصيل لإجراء التحليل. بالإضافة إلى ذلك، تظهر لقطات تحليل المذنب في الشكل 2 ألف-جيم. صور المذنب الممثل لعنصر التحكم وميتوتريكسات (دوكسو)-يرد في الشكل 3 ألف-جيمالخلايا المعالجة المتكاملة والتحديد الكمي للمذنبات.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. رد تلف الحمض النووي
<ol><li>إعداد العينات، والكاشف
	<ol>
<li>لثقافة خلية المتكاملة-سم، ثقافة المؤسسة-سم الخلايا في الطابق السفلي-غشاء-ماتريكس-المغلفة (انظر الجدول للمواد) لوحات الثقافة في المتوسط ربمي تكملة مع B-27 (CMM) حتى يتم التوصل إلى كونفلوينسي. ملاحظة: واستخدمت كارديوميوسيتيس الإنسان-أي بي إس-خلية-المستمدة في هذا البروتوكول. يمكن الاطلاع على البروتوكول المتعلق بتمايز خلايا iPS في cardiomyocytes في المقالات الأخيرة من أعمالنا البحث مجموعة12،13،21.</li>
		<li>البذور CMs iPS في شرائح الدائرة.<ol>
<li>تجاهل المتوسطة الثقافة من آبار iPS-سم. تغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.</li>
			<li>أضف 1 مل التربسين 0.25% من كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 الاختيار لوحة تحت مجهر للخلايا المفرزة. أضف 1 مل CMM لوقف التربسين.</li>
			<li>وضع تعليق خلية في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و 200 x ز. تجاهل على المديين المتوسط وإضافة 1 مل CMM ريسوسبيند الخلايا. عد الخلايا وضبط عدد الخلايا للحصول على 20 × 105 خلايا في 1.6 مل CMM.</li>
			<li>بذور الشريحة 200 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة من الدائرة 8-جيدا جيدا (انظر الجدول للمواد). انقر فوق الشريحة بلطف لانتشار الخلايا حول البئر واحتضان عند 37 درجة مئوية.</li>
		</ol>
</li>
		<li>لعلاج سم iPS ميتوتريكسات، تجاهل المتوسطة الثقافة من آبار iPS-سم. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. علاج الخلايا مع 1 ميكرومتر ميتوتريكسات و CMM ل 4 h. نضح المتوسطة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>لحظر المخزن المؤقت، وإعداد 10 مل محلول ألبومين المصل البقري (BSA) يحتوي على جيش صرب البوسنة 3% و 0.05% X-100 تريتون. لإعداد 10 مل من المخزن المؤقت لحظر، إضافة 1 مل مصل حمار العادية إلى 9 مل من استعداد جيش صرب البوسنة الحل.</li>
		<li>لحل جسم الأولية، إضافة 1 ميكروليتر من H2A أرنب المضادة والرمات--هيستون. × جسم (Ser139) إلى 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر.</li>
		<li>لهذا المزيج جسم الثانوية، إضافة ميكروليتر 1 كل مترافق fluorochrome جسم الأرنب المضادة الثانوي و DAPI وفالويدين fluorochrome مترافق إلى 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر.</li>
	</ol></li>
	<li>إيمونولابيلينج
	<ol>
<li>تغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من طازجة 4% بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت حظر كل بئر وكتلة لمدة 30 دقيقة في قاعة هوميديفيد في درجة حرارة الغرفة. إزالة المخزن المؤقت حظر وإضافة 200 ميكروليتر من حل جسم الأولية. احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مظلمة، هوميديفيد في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مظلمة، هوميديفيد في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. يغسل مع دي ح2س قبل تركيب لهم مع أنتيفادي. ضع كوفيرجلاس وتخزين الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي، أخذ الصور ثلاثة إلى خمسة حقول عشوائية العينة، كما هو موضح في الشكل 4A، والمضي قدما إلى تحليل الصور.</li>
	</ol></li>
	<li>عد البؤر التسريح وإعادة الإدماج
	<ol>
<li>تنزيل وتثبيت سيلبروفيلير24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
ملاحظة: تم إجراء معالجة الصور في هذه الدراسة باستخدام سيلبروفيلير الإصدار 2.1.1. دروس عن سيلبروفيلير التي تم استخدامها ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & قائمة = PL7CC87670239B4D10). في حالة استخدام إصدار أحدث من سيلبروفيلير، خط الأنابيب قد تتطلب تعديلات طفيفة.</li>
		<li>تحميل خط أنابيب punctae_gH2AX.cpipe. حدد ملف > استيراد > خط الأنابيب من الملف واختر punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>السحب والإفلات المجلد الذي يحتوي على الصور المكتسبة من بؤر γH2A.X إلى الإطار قائمة الملفات في المقطع وحدات الإدخال/صور للتحليل (الشكل 5A). ثم اتبع التعليمات كما هو موضح في الشكل 5 ألف-L.</li>
		<li>تعيين المعلمات التالية للصور:<ol>
<li>اسحب الصورة المرجوة للتحليل إلى القائمة ملف. ضمن وحدات الإدخال، حدد الصور (انظر الشكل 5A لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات الإدخال، حدد البيانات الفوقية (انظر الشكل 5B لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات الإدخال، حدد ناميساندتيبيس (انظر الشكل 5 لإعدادات الوحدة النمطية).</li>
			<li>الفئات، حدد لا. في وحدات التحليل، حدد كولورتوجراي (انظر الشكل 5 لإعدادات الوحدة النمطية).</li>
		</ol>
</li>
		<li>في وحدات التحليل، حدد السلس (انظر الشكل 5E إعدادات الوحدة النمطية). ملاحظة: هذه القيمة قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل، استناداً إلى دقة الصورة.</li>
		<li>في وحدات التحليل، حدد إيدينتيفيبريماريوبجيكتس (انظر الشكل 5F لإعدادات الوحدة النمطية). ملاحظة: تحسين هذه القيم تأكد من تحديد نواة كاملة. بعد هذه الخطوة، قد تتخلف الكمبيوتر.</li>
		<li>في وحدات التحليل، حدد السلس (انظر الشكل 5 لإعدادات الوحدة النمطية). ملاحظة: هذه القيمة قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل، استناداً إلى دقة الصورة.</li>
		<li>في وحدات التحليل، حدد انهانسيورسوبريسفيتوريس (انظر الشكل 5 ح لإعدادات الوحدة النمطية).</li>
		<li>في وحدات التحليل، حدد إيدينتيفيبريماريوبجيكتس (انظر الشكل 5I لإعدادات الوحدة النمطية). ملاحظة: تحسين هذه القيم للتأكد من بونكتاي تم تحديدها. بعد هذه الخطوة، قد تتخلف الكمبيوتر مرة أخرى.<ol>
<li>في وحدات التحليل، حدد ريلاتيوبجيكتس (انظر الشكل 5 ياء لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات التحليل، حدد كلاسيفيوبجيكتس (انظر الشكل 5 ك لإعدادات الوحدة النمطية). في وحدات التحليل، حدد اكسبورتوسبريدشيت (انظر الشكل 5 لتر لإعدادات الوحدة النمطية).</li>
			<li>انقر فوق تحليل الصور في أسفل اللوحة اليمنى إجراء تحليل للصورة. عند الانتهاء الناجح للتحليل، يتم إنشاء العديد من الصور (الشكل 6A-F). ملاحظة: وينبغي للمستخدمين حفظ هذه الصور للرجوع إليها في المستقبل.</li>
			<li>ملاحظة الملف.csv الذي يحتوي على البيانات الكمية لمزيد من التحليل التي تم إنشاؤها وحفظها في الموقع المناسب على الكمبيوتر. في جدول يسمى MyExpt_Image، والأعمدة B و D سيكون عدد الأنوية التي قد إلى خمسة وأكثر بونكتاي، على التوالي. إضافة الأعمدة B و D للحصول على إجمالي عدد الأنوية.</li>
		</ol>
</li>
		<li>كرر الخطوة 2.3.3-2.3.8 لجميع الصور (تغيير اسم الملف MyExpt_ قبل كل تحليل). ويمكن إجراء قطع لتقييم سلامة الحمض النووي، كما هو مبين في الشكل 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
<li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li>
<li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals%2C+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li>
<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li>
<li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li>
<li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li>
<li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+reliable+comet+assay%3A+optimising+agarose+concentration%2C+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

سلامة الحمض النووي يصور سلامة الخلية. الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي تضررت كثيرا في الإجهاد وتفقد سلامتها في نهاية المطاف. سلامة الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تنتشر غرض الزرع الرئيسي للخلايا لأداء وظيفتها المطلوبة. زرع خلايا بتلف الحمض النووي سيؤدي في معدل انجرافتمينت الفقيرة والأداء في الخلية8،20. ولذلك، فحص سلامة الحمض النووي قبل زرع الخلايا بروتوكول مراقبة الجودة اللازمة. هنا يصف لنا هما النهج الفعالة من حيث التكلفة، إلا وهي المذنب المق...

وتبين الأدلة التجريبية والسريرية أن زرع الخلايا يمكن معتدلة لتحسين أداء البطين الأيسر الهوس من فشله في قلوب1،2،،من34،5 ،،من67،،من89. التطورات الأخيرة قد فتحت زيادة جاذبية الفرص لإنعاش القلب والأوعية الدموية؛ وتشمل هذه التعبير القسري من عوامل إعادة برمجة خلايا جسدية للحث على بلوريبوتينسي وتفرق هذه الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (التوجيهية) في الأنساب القلب مختلفة، ومن المهم كارديوميوسيتي (سم)10، 11 , 12 , 13-المواد الوراثية في كل خلية، بما في ذلك إيبسكس الذي تم إنشاؤه اصطناعياً والمستمدة من اللجنة التوجيهية سم (iPS-سم)، هو الحمض النووي. ويملي التعليمات الوراثية المخزنة في الحمض النووي النمو والتنمية، ووظيفة الخلايا والأنسجة، وأجهزة، والكائنات الحية. الحمض النووي ليست خاملة؛ خلية الأيض، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل، والأنواع النيتروجين، و alkylating وكلاء يمكن أن الحمض النووي يسبب الضرر في المختبر والمجراه في14،15،،من1617. الأهم من ذلك، يحدث تلف الحمض النووي بداهة في كل خلية، بتواتر كبير. إذا لم يتم تصحيح هذه الأضرار، فإنه سيؤدي إلى طفرة الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وفقدان سلامة الحمض النووي، والخلية، وربما، من الأمراض، بما في ذلك السرطان تهدد الحياة. لذلك، الإبقاء على سلامة الحمض النووي ضروري لأي خلية، وبخاصة إيبسكس، التي تتمتع بإمكانات هائلة في العيادة.
لتقييم كمية والسلامة لعزل الحمض النووي، تتوفر معدات باهظة الثمن في السوق. ومع ذلك، هناك أية أساليب بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا دون عزل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تدهور الحمض النووي الناجم عن المستخدم أثناء عزل الحمض النووي أحد العوائق الرئيسية في استخدام هذه الأساليب. هلام خلية واحدة التفريد (المعروفة بمقايسة المذنب)18،19 و γH2A.X إيمونولابيلينج8 التقنيات هي النهج الأساسية في مختبرات البحوث لتقييم الأضرار في الحمض النووي. هذان الأسلوبان لا تتطلب معدات باهظة الثمن أو عزل الحمض النووي لتحليل الحمض النووي سلامة8،،من2021. منذ ذلك الحين، تم إجراء هذه التقنيات مع خلايا كاملة؛ الحمض النووي/رنا/البروتين تدهور المستحثة بالمستخدم أثناء إعداد عينة لن يؤثر على هذه البروتوكولات. هنا، لتقييم أضرار الحمض النووي والحمض النووي الضرر ردا في الساق والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية، ونحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتنفيذ كلا المذنب المقايسة و γH2A.X إيمونولابيلينج. وعلاوة على ذلك، الجمع بين هذين النهجين، نقترح إجراء تقييم السذاجة التي يمكن استخدامها لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء.
مقايسة المذنب، أو خلية واحدة جل التفريد، تدابير فواصل الحمض النووي في الخلايا. يتم تفكيك الخلايا المضمنة في [اغروس] انصهار منخفضة بشكل نوكليويدس التي تحتوي على الحمض النووي سوبيركويليد. عند التفريد، ترحيل قطع صغيرة من الحمض النووي مجزأة وقطع خيوط الحمض النووي عن طريق المسام [اغروس]، حين دنا سليمة، بسبب حجمها الهائل بالاقتران مع البروتين المصفوفة، سيكون هجرة مقيدة. يحاكي نمط الحمض النووي الملون تحت مجهر fluorescence مذنب. رأس المذنب يحتوي على الحمض النووي سليمة وهو يتألف من أجزاء الذيل وكسر خيوط الحمض النووي. ويمكن قياس جزء صغير أضرار الحمض النووي بشدة الأسفار من تلف الحمض النووي (ذيل المذنب) بالنسبة إلى كثافة الحمض النووي (رأس المذنب) سليمة. يمكن حساب هذه اللحظة ذيل معلمة كما هو مبين في الشكل 1.
أضرار الحمض النووي يؤدي إلى الفسفرة هستون H2A. X (γH2A.X) في Ser139 التي مؤنزم ATM و ATR الحمض النووي-PK. الفسفرة وتجنيد H2A. X في فواصل حبلا الحمض النووي يسمى استجابة تلف الحمض النووي (DDR) ويحدث سريعاً بعد أن تلف الحمض النووي. وفي أعقاب هذه العملية، والقبض على نقطة تفتيش بوساطة دورة الخلية والحمض النووي هي بدأت عمليات إصلاح. بعد الانتهاء الناجح لإصلاح الحمض النووي، ديفوسفوريلاتيد γH2A.X وإبطال من فوسفاتاسيس. لفترات طويلة ومتعددة فواصل حبلا الحمض النووي يؤدي إلى تراكم البؤر γH2A.X في الحمض النووي. وهذا يشير إلى عدم التمكن من إصلاح أضرار الحمض النووي وسلامة الحمض النووي للخلية. يمكن تحديد هذه البؤر γH2A.X في الحمض النووي، ويمكن حساب عدد البؤر التسريح وإعادة الإدماج باستخدام البروتوكول في الباب 2.

<table><tbody><tr><td>0.25٪ تريبسين</td><td>كورنينج</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>شريحة غرفة 8 آبار</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>محلول انفصال الخلية</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>Laboratories 711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الألبومين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno مختبرات الأبحاث</td><td>711-165-152 (RRID: AB_2307443) مكمل</td><td></td></tr> <tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 ، مصل خال من المصل ،</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو Matrigel تقليل</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>تقنيات الخلايا الجذعية</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>PhalloidinA488</td><td>Life Technology</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Histone H2A. X (Ser139)</td><td>تقنية إشارات خلايا</td> الأجسام <td>المضادة 2577 (RRID: AB_2118010) RPMI</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; جرين I صبغة هلام الحمض النووي</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

تقييم سلامة الحمض النووي الخلايا الجذعية للعلاج بخلايا القلب

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية لديها إمكانات هائلة كعلاج التجديدي لمختلف الأمراض التنكسية. الحمض النووي هو مستودع البيانات الوراثية في كافة الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية، وسلامتها أمر أساسي لقدرتها على التجدد. الخلايا الجذعية البالغة الخضوع للنشر السريع في مختبرات لتحقيق الأرقام اللازمة للزرع. نمو الخلايا السريع يؤدي إلى فقدان سلامة الحمض النووي والايضات المتراكمة، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل alkylating وكلاء. زرع هذه الخلايا سيسفر engraftment الفقيرة وتجديد الجهاز المتدهورة. وعلاوة على ذلك، زرع الخلايا التالفة الحمض النووي يؤدي إلى طفرات، عدم الاستقرار الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وربما تهدد الحياة من الأمراض مثل السرطان. ولذلك، هناك حاجة ملحة لأسلوب مراقبة الجودة لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء. هنا، نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتقييم سلامة الحمض النووي للخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.

تم استزراع الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent، وتلف الحمض النووي ولحظة الذيل، التي كانت تستخدم كمقياس لسلامة الحمض النووي، حللت بمقايسة المذنب. كانت جزءا لا يتجزأ من نقطة انصهار منخفضة [اغروس] خلايا iPS ووضعها على شريحة زجاجية. وعولج الخلايا، ثم، مع تحلل المخزن المؤقت، تليها حلاً قلوية، للحصول على الحمض النووي سوبيركويليد. كانت اليكتروفوريسيد نوكليويدس وكانت تصور المذنبات بصبغ الحمض النووي (الشكل 1A-د). ثم حللت المذنبات مع إيماجيج، ...

هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية لإجراء تحليل لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

بالنسبة لأمراض حديثي الولادة مثل اعتلال عضلة القلب، فإن العلاج التجديدي باستخدام الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة له إمكانات هائلة. ومع ذلك، في المختبر تسارع نمو الخلايا يؤدي إلى تلف الحمض النووي من قبل الأيض المتراكمة مثل أنواع الأكسجين التفاعلي. زرع هذه الخلايا التالفة الحمض النووي من شأنه أن يؤدي إلى ضعف الغرة وتجديد العضو.قبل الزرع، ينبغي تقييم نوعية الخلايا. هنا نقدم بروتوكولين خطوة بخطوة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا الجذعية. ومن خلال عرض الإجراءات، ستكون جيسيكا ميلر، الباحثة، ونيخيل ماردهيكار، الباحث، وفاشانثي راجاسيكران، وهو فني مختبر.للبدء، ضع 500 ملليغرام من الأذانروز منخفض الذوبان في 100 ملليلتر من المياه الخالية من الحمض النووي الريبي النووي الريبي. سخني الزجاجة في فرن ميكروويف حتى يذوب الأاغروز. ثم ضع الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى الحاجة.لإعداد شرائح المذنب المغلفة مسبقًا ، ضع بضع قطرات من 0.5٪ agarose على شريحة زجاجية. انتشرت على الفور agarose لتشكيل طبقة رقيقة من طلاء agarose باستخدام غطاء. العمل في ظروف الإضاءة المنخفضة لتجنب تلف الخلايا الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، وخلط 10 ميكرولترات من تعليق الخلية و 90 ميكرولترات من محلول agarose في أنبوب.ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمنع الأاغروز من التجمد. اخلط الحل دون إدخال فقاعات الهواء، والماصات 70 ميكرولترات لكل بقعة على شريحة المذنب المطلية مسبقًا. باستخدام طرف ماصة، انتشار خليط agarose الخلية لتشكيل طبقة رقيقة.ضع الشريحة عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. في وعاء ، غمر تماما الشريحة في عازلة التحلل البارد. ضع الحاوية في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.استبدال العازلة تحلل مع محلول قلوي الباردة. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل. بعد ترك الحاوية في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى ، ضع الشريحة في خزان كهربائي أفقي.املأ الخزان بمخزن كهرباء قلوي بارد حتى تغمر الشرائح تمامًا. تطبيق الجهد في فولت واحد لكل سنتيمتر لمدة 15 إلى 30 دقيقة. في وعاء، غمر تماما الشريحة في المياه الباردة ديونيد.بعد دقيقتين، إزالة المياه ديونيد وإضافة المياه الأيونية العذبة، ثم كرر هذه الخطوة مرة ثانية. بعد ذلك، استبدل الماء الأيوني بالماء البارد بنسبة 70٪ الإيثانول. بعد خمس دقائق، قم بإزالة الشريحة بلطف دون إمالةها واتركها جافة.مرة واحدة المجففة، إضافة 100 ميكرولترات من صبغة الحمض النووي المخفف إلى كل بقعة، وانتظر 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام مرشح FITC في مجهر epifluorescence، التقاط صور من 50 إلى 100 المذنبات في المجموع لكل عينة. الخلايا القلبية المشتقة من iPS الموروثة كما هو موضح في بروتوكول النص.لرؤية خلايا القلب المشتقة من iPS في شرائح الغرفة ، تخلص أولاً من وسيط الثقافة من الآبار ، وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين في البئر، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحقق من اللوحة تحت المجهر فصاخل الخلية.ثم إضافة ملليلتر واحد من CMM لوقف تريبسين. وضع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 200 مرة ز. تجاهل المتوسطة، وإضافة ملليلتر واحد من CMM، وإعادة ضغط الخلايا.عد الخلايا وضبط عدد الخلايا للحصول على مليوني خلية في 1.6 ملليلتر من CMM. بذور الآن 200 ميكرولترات من تعليق الخلية في بئر من شريحة غرفة ثمانية بئر. اضغط على الشريحة بلطف لنشر الخلايا حول البئر.احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. لعلاج دوكسيروبايسين المستمدة من iPS، تخلص من الوسيلة الثقافية من آبار القلب والوثنيين المشتقة من iPS، وغسل الخلايا بـ PBS. علاج الخلايا مع دوكسوروبيسين ميكرومولار واحد لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية.التعرق المتوسطة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. لأداء مناعي، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من الطازجة المعدة 4٪ شبهformaldehyde إلى كل بئر. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، إضافة 200 ميكرولترات من العازلة سد في البئر، وكتلة لمدة 30 دقيقة في غرفة مرطب في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر وإضافة 200 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأساسي. بعد احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مرطبة داكنة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS.إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة الثانوية. احتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة مرطبة داكنة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.غسل مع المياه ديونيد قبل تركيب الشرائح مع antifade. ضع غطاء زجاجي، واخزن الشرائح في الظلام عند أربع درجات مئوية. باستخدام المجهر confocal، واتخاذ ثلاث إلى خمس صور من الحقول العشوائية لكل عينة والمضي قدما في تحليل الصور.لحساب استجابة الضرر DNA بؤرة، تحميل وتثبيت CellProfiler. حدد ملف واستيراد وخط أنابيب من الملف واختر ملف خط أنابيب يسمى puncti غاما H2AX. سحب وإسقاط المجلد الذي يحتوي على الصور المكتسبة من غاما-H2AX foci إلى إطار قائمة الملفات في قسم الصور وحدات الإدخال لتحليلها.ثم اتبع الإرشادات كما هو موضح في بروتوكول النص. لتعيين معلمات الصور، اسحب الصورة المطلوبة للتحليل إلى قائمة الملفات. ضمن وحدات الإدخال، حدد الصور.أيضاً في وحدات الإدخال، حدد بيانات التعريف، ثم حدد الأسماء والأنواع. بالنسبة للمجموعات، حدد لا. العمل في وحدات التحليل، حدد اللون إلى الرمادي.ثم حدد السلس، حدد تحديد الكائنات الأساسية، ومرة أخرى حدد السلس. حدد التالي تحسين أو إيقاف الميزات، ثم حدد تحديد الكائنات الأساسية. لا يزال يعمل في وحدات التحليل، حدد ربط الكائنات، ثم تصنيف الكائنات، وأخيراً حدد التصدير إلى جدول البيانات.انقر على تحليل الصور في اللوحة السفلية اليمنى لإجراء تحليل الصورة. وعند الانتهاء من التحليل بنجاح، يتم إنشاء عدة صور. لاحظ ملف CSV الذي تم إنشاؤه وحفظه في الموقع المناسب على الكمبيوتر.يحتوي هذا الملف على البيانات الكمية لمزيد من التحليل. في جدول البيانات يسمى صورة تجربتي ، والعمود باء سيكون عدد النوى التي تصل إلى خمسة puncti ، والعمود دال سيكون عدد النوى التي لديها أكثر من خمسة puncti. إضافة الأعمدة B و D للحصول على العدد الإجمالي للنيات.كرر هذه الخطوات لكافة الصور، وتغيير اسم ملف التجربة قبل كل تحليل. تظهر هنا صور ميكروجراف تمثيلية للمذنبات من خلايا iPS المعالجة بالدوكسو وغير المعالجة. تم العثور على كمية القاعدية من تلف الحمض النووي في خلايا iPS ، التي تم التعبير عنها كجزء صغير من تلف الحمض النووي ولحظة الذيل.ومع ذلك، زاد علاج دوكسو من تلف الحمض النووي في خلايا iPS كما هو متوقع، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام مقايسة المذنب لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية متعددة القدرات. تظهر هنا ميكروجراف تمثيلية من مناعة غاما-H2AX، عند التكبير الأقل وفي التكبير الأعلى. في التحكم iPS المشتقة من cardiomyocytes، أكثر من 90٪ من الخلايا كان أقل من خمسة DDR foci لكل نواة.وكان ما مجموعه أقل من 10٪ من الخلايا أكثر من ستة DDR foci لكل نواة. بالنسبة لـ iPS المستمدة من القلب وتربية لمدة ستة أشهر، كان أقل من 90٪ من الخلايا تصل إلى خمسة DDR foci لكل نويات، وما مجموعه أكثر من 13٪ من الخلايا كان أكثر من ستة DDR بؤر لكل نوى. في حين أن في doxo-iPS المستمدة من القلب، وأقل من 80٪ من الخلايا كان ما يصل إلى خمسة DDR foci لكل نواة.وكان ما مجموعه حوالي 24٪ من الخلايا أكثر من ستة بؤر DDR لكل نوى. وتشير هذه البيانات إلى أن فترة طويلة من iPS المشتقة من القلب وزراعة الخلايا والعلاج doxo تسبب ضررا كبيرا الحمض النووي، مما يجعلها غير صالحة لزرع الخلايا. من المهم جدا تجنب المتغيرات أثناء خلط تعليق الخلية، لأن هذا قد يؤثر على الكهرباء.بعد هذا الإجراء، يمكنك إجراء المقايسات المذنب وإجراءات مناعة مع الخلايا من أنواع مختلفة. وستتيح هذه التقنيات تقييم الخلايا من مختلف الأنواع لتلف الحمض النووي قبل استخدامها في دراسات زرع الخلايا.

assessing-stem-cell-dna-integrity-for-cardiac-cell-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

يتم عزل نواة القلب عن طريق الترسيب وكثافة immunolabeled مع الأجسام المضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) لتحديد وفرز النوى cardiomyocyte بواسطة التدفق الخلوي.

العزلة نوى Cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة

نحن هنا تصف في الجسم الحي الطفرات فحص لأعداد صغيرة من الخلايا المكونة للدم تنقيته باستخدام اسي نموذج الفأر وراثيا. الجين اسي يمكن عزل لتحديد التردد، والموقع، ونوع من المسوخ الحمض النووي نشأت عفويا أو بعد التعرض لgenotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للتمييز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في العضلية عن طريق تحوير انتقائي مسار WNT، تليها تحليل التدفق الخلوي من علامات مرجعية لتقييم تجانس وهوية السكان.

التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي

يعد القياس الكمي لدوران خلايا عضلة القلب أمرا صعبا. يقدم البروتوكول الموصوف هنا مساهمة مهمة في هذا التحدي من خلال تمكين القياس الكمي الدقيق والحساس لتوليد نوى خلايا عضلة القلب الجديدة وعدد النوى.

تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

نقدم ثلاثة بروتوكولات جديدة وأكثر كفاءة للتمييز الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان إلى العضلية، والخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء وطريقة التسليم أن يحسن engraftment من الخلايا المزروعة عن طريق الجمع بين حقن الخلايا مع بوساطة التصحيح تسليم خلوى.

المحفزة الخلايا الجذعية المشتقة خلايا القلب لإصلاح عضلة القلب

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا خطوة بخطوة لإنشاء وقياس أنواع فرعية متنوعة من القلب المعاد برمجتها باستخدام توصيل بوساطة الفيروسات القهقرية ل Gata4 و Hand2 و Mef2c و Tbx5.

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

هنا، فإننا نقدم أسلوباً لكفاءة الاستفادة من إمكانات التمايز القلب الشباب مصادر الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية بغية توليد خلايا وظيفية، المتعاقدة، مثل كارديوميوسيتي في المختبر.

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

والهدف العام لهذه المادة توحيد البروتوكول لعزل وتوصيف، وتمايز الخلايا الجذعية القلبية (CSCs) من قلب الماوس الكبار. هنا، يمكننا وصف أسلوب الطرد المركزي تدرج كثافة لعزل CSCs موريني ووضع أساليب لديوان الخدمة المدنية الثقافة وانتشارها، والتمايز في cardiomyocytes.

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

في هذا البروتوكول، نقوم بشرح وتفصيل كيفية استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان للتمايز وتنقية خلايا القلب، والمزيد، حول كيفية تحسين كفاءتها في زرع مع مثبطات كيناز البروتين المرتبطة بـ Rho المعالجة المسبقة في نموذج احتشاء عضلة القلب الماوس.

تعزيز تطعيم خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان عن طريق تثبيط عابر لنشاط رو كيناز

هنا ، نعرض طريقة تقييم انقباض الأجهزة الطبية القلبية غير الغازية باستخدام أحاديات الطبقة العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية 2D (hiPSC-CM) ، المطلية على ركيزة مرنة ، إلى جانب الفحص المجهري القائم على الفيديو. ستكون هذه الأداة مفيدة للتقييم في المختبر للخصائص المقلصة لأجهزة الفيزيولوجيا الكهربية للقلب.

تقييم علاج تعديل انقباض القلب في خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية 2D

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.

عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة

تعلم بروتوكولات تقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية المستحثة قبل زراعتها لعلاج أمراض القلب. تضمن هذه الطرق جودة الخلايا ونجاح العلاج التجددي.

تقييم سلامة الحمض النووي الخلايا الجذعية للعلاج بخلايا القلب

استكشف المزيد من الفيديوهات