تقييم البارامترات أعصاب Ultrastructural بعد في توصيل الرحم النامي الماوس المخ والحبل الشوكي

يساعد نهجنا المشترك في الإجابة على كيفية تغير معلمات المرونة العصبية فائقة البنية بعد التدخلات التنموية المبكرة للجهاز العصبي الوليد في الرحم. الميزة الرئيسية لطريقتنا هي الحصول على صور عالية الدقة من الهياكل الصغرى والصغرى في نظام الإحداثيات المحددة مسبقاً داخل أطلس الأنسجة. ويعني هذا الأسلوب أن قدرتها العلاجية الترجمية للأمراض العصبية الخلقية.

على سبيل المثال، العلاج والإنقاذ في مراحل الجنين باستخدام هذا في تقنية نقل الرحم. ويمكن تطبيق أسلوبنا على أي نموذج آخر. على سبيل المثال، يمكن تغيير أنواع الماوس، وكذلك منطقة الاهتمام.

يحتاج الباحثون الذين يحاولون طريقتنا لأول مرة إلى تدريب جراحي عميق، بالإضافة إلى معرفة كيفية إعداد الأنسجة للتصوير المجهري الإلكتروني. تبدأ عن طريق تحميل تلميح شعري مخصص تحتوي على أربع مرات 10 إلى 11 جزيئات الفيروسية من الفيروس المرتبط أدينو نوع 1 طلاء للهدف المطلوب، ووصفت مع صبغة خضراء سريعة على أنبوب الpirator. أضف 15 ميكرولترات من جزيئات الفيروس المرتبطة بـ adeno المسماة في الشعيرات الدموية.

بعد ذلك، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القار في يوم جنيني مُغدَّد 14.5 فأرة حامل، وطهر الجلد. استخدام ملقط قزحية مسننة منحنية ومقص كربيد التنغستن مستقيم لجعل شق الجلد على طول linea mediana. باستخدام ملاقط دومون المستقيمة لقبضة الجدار البريتوني ، استمر على طول ألبا linea مع مقص Vannas المستقيم ووضع قطعة من فيلم البارافين المقننة فوق فتحة البطن واستخدام جهاز يشبه الملعقة لفضح قرون الرحم دون إتلاف الأجنة داخل القرون.

بعد تطبيق بضع قطرات من برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية على قرون الرحم، وفحص الأجنة للأضرار أو التشوهات داخل كيس الرحم. بدوره الأجنة بعناية داخل الحويصلات الخاصة بهم حتى يتم تحقيق الموقف المطلوب لكل حقن. عندما تكون الأجنة في مكانها، تحقن من واحد إلى اثنين من ميكرولترات من محلول جسيمات الفيروس المسمى "Fast Green" في كل جنين.

بعد أن تم حقن جميع الأجنة ، ضع قرون الرحم مرة أخرى في تجويف البطن ، وأضف بضع قطرات من PBS 37 درجة مئوية في البطن. ثم استخدام البولي أميد 6-0 خياطة الحجم لإغلاق الجدار البريتوني والبولي أميد 3-0 خياطة الحجم وهالستيد البعوض المحفّزة لإغلاق الجلد. لتضمين الأنسجة المعزولة ذات الأهمية للتصوير عن بعد الكلي، ضع عينة الأنسجة في إطار خاص مع زاوية المقطع القابلة للتكرار، ووثيقة الإحداثيات.

املأ الإطار بـ 30 درجة مئوية بنسبة 3٪ agarose حتى يتم تغطية الأنسجة، وغطي الإطار بغطاء بلاستيكي حتى تصلب الأاروز. في حين أن agarose هو تصلب، واستخدام جهاز الرسم عن بعد الماكرو لصورة الأنسجة المدمجة وإحداثياتها داخل الإطار. عندما ترسّك الأاغروز، قم بنقل الأنسجة المضمّنة من أغاروز إلى الإطار مع قطع الثغرات المقابلة لإحداثيات الإطار الأول.

استخدم جهازًا بشفرة حلاقة رقيقة ومهتزة لقطع الأنسجة المضمنة إلى أجزاء من سمك تجريبي مناسب. ثم صورة كل قسم الأنسجة في برنامج تلفزيوني، وجمع الصور في مجلد. لإعداد عينات الأنسجة للمجهر الإلكترون انتقال، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وغسل أقسام الأنسجة مع اثنين من غسل 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني، تليها حضانة لمدة ساعتين في 2٪ ae ae أوسميوم التيروكسيل حل في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة، وغسل أقسام osmicated مرتين أكثر في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لكل غسل وتجفيف المقاطع في غمر الإيثانول متتابعة 10-15 دقيقة كما هو مبين. بعد غمر الإيثانول 70٪، ضع كل عينة في طبق أسود على خلفية سوداء باهتة وصورة العينات في 70٪ الإيثانول تحت ضوء RGB LED المطبقة على العينات من الجانبين الأيسر والأينى في زوايا 45 درجة. إنشاء أطلس من الصور المقطع مع الإحداثيات عن طريق جمع صور من العينات في سلسلة في مجلد.

علاج العينات مع اثنين من 30 دقيقة 100٪ إيثانول الحضانة، تليها اثنين من 30 دقيقة 100٪ 100٪ حضانات أكسيد البروبيلين، وكلاهما في درجة حرارة الغرفة. في حين أن العينات هي احتضان، مزيج الراتنج الطازجة مع أكسيد البروبيلين في واحد إلى واحد ونسب واحد إلى اثنين، وإضافة 3٪ مسرع لكلا الحلين. بعد حضانة أكسيد البروبيلين الثاني، نقل العينات إلى واحد إلى اثنين أكسيد البروبيلين الراتنج تضمين حل متوسط لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، تليها حضانة لمدة ساعتين في واحد إلى واحد أكسيد البروبيلين تضمين محلول متوسط في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة الثانية، نقل الأنسجة إلى أطباق البولي بروبلين شقة، وعلاج الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الراتنج الطازجة التي تحتوي على 3٪ مسرع لمدة 12 إلى 24 ساعة في 65 إلى 85 درجة مئوية. ثم تبريد الأنسجة إلى درجة حرارة الغرفة، وإزالة العينات الراتنج جزءا لا يتجزأ من أطباق البولي بروبلين. لتعيين منطقة ذات أهمية، حدد صورة تحتوي على منطقة الاهتمام من أطلس الصور المعد مسبقًا.

رسم حدود المنطقة ذات الأهمية على الصورة المقسمة ، فرض هذه الحدود بصريا على عينة جزءا لا يتجزأ تحت المجهر ، واستخدام واحد بوصة 26 قياس الإبرة لخدش هذه الحدود المنطقة على عينة الراتنج. ثم، تسخين العينات إلى 95 درجة مئوية من أجل تليين الراتنج. بعد ذلك، أخرج عينات الراتنج الدافئ من الفرن، واستخدم شفرة حلاقة لاستخراج المناطق ذات الاهتمام.

الغراء العينات على الزجاج الاكريليك عقد القضبان من العيار المناسب، وتقليم العينات التي شنت لالقطع شبه ورفيق جدا. استخدام ultramicrotome للحصول على شبه رقيقة 0.7 ميكرومتر و فائقة رقيقة 70 نانومتر أقسام، وجمع أقسام شبه رقيقة على ناقلات الزجاج، والأقسام رقيقة جدا على شبكات النيكل. وصمة عار المقاطع شبه رقيقة مع 1٪ Toluidine الأزرق في برنامج تلفزيوني لمدة أربع دقائق، تليها عدة يغسل في الماء الأيون، قبل فحص المقاطع عن طريق المجهر الخفيفة.

ويمكن بعد ذلك تقييم الأجزاء الرقيقة للغاية مباشرة عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال عند 180 كيلوفولت دون مزيد من التعديل. بعد قسم، يتم تصوير شرائح الأنسجة عن طريق التصوير عن بعد الماكرو كما أظهرت للتو. بعد التخبط والإيثانول الغمر، يتم تصوير المقاطع مرة أخرى عن طريق التشويش عن بعد، وكشف عن نمط الملونة خصيصا لكل سطح الأنسجة.

بعد الجفاف إضافية والراتنج تضمين، يتم اختيار المناطق ذات الاهتمام ومعالجتها كذلك لنقل المجهر الإلكتروني. في قرن آمون والمخيخ، ومن المعروف أن نقاط الاشتباك العصبي الألياف الطحلبية أن يحمل خصائص ultrastructural فريدة بالمقارنة مع نقاط الاشتباك العصبي الأخرى، بما في ذلك bouة كبيرة. في ملفات التعريف المقطعية الخاصة بهم، تحتوي التاونونات على عدد كبير من الفُيصلات والميتوكوندريا، وغالباً ما تُرفق العديد من الأشواك المتجرّدة.

في الحبل الشوكي، يحتوي الـ"ثيرول" على العديد من الألياف المحورية التي تحتوي على النخاعي من قبل oligodendroglia. في المقاطع العرضية ، يمكن العثور على السطح الجانبي الظهري بين كلا القرون الخلفية للحبل الشوكي. على نقل صور المجهر الإلكترون، المحاور النخاعية المقطعة تظهر الجولة، ويتم تنظيم اغلاد المايلين المحيطة محاور في لميلاي.

الأطلس المعد وصور التصوير المجهري للإلكترونات المُعدة للبارامترات الفائقة البنية ليست مفيدة فقط للمقارنة بين المرونة العصبية المورفولوجية لمختلف الأقسام في ظل ظروف العلاج المختلفة، ولكن أيضاً للمقارنة بين المعلمات داخل نفس المنطقة. تذكر أن تخطط بدقة والاستعداد قبل البدء في تحويل الرحم، والتأكد من أن يكون النسخ الاحتياطي للمواد والأدوات في حالة حدوث مضاعفات. بعد طريقتنا، يمكن إضافة تقنيات أخرى مثل وضع العلامات المناعية قبل المجهر الإلكتروني لتتبع ultrastructural من جزيء محدد من الفائدة.

بدءا من نظرة شاملة للكائن الحي بأكمله والتكبير نحو التضاريس الجزيئية، ونحن قادرون على دراسة والتلاعب في العلاقة بين وظيفة الأنسجة والمورفولوجيا. أوزميوم تتراوكسيد خطر. تأكد من العمل دائمًا تحت غطاء محرك السيارة، وارتداء نظارات واقية وقفازات يدوية عند العمل مع هذا الكاشف.