ميكروفوكس الأشعة السينية CT (microCT) التصوير من أكتينيا إكوينا (Cnidaria)، Harmothoe sp. (Annelida)، وXenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

هنا، يتم شرح بروتوكولات إجراء التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية (microCT) لثلاثة من الحيوانات اللافقارية البحرية بالتفصيل. تصف هذه الدراسة خطوات مثل تثبيت العينة، وتلطيخ العينة، والتركيب، والمسح الضوئي، وإعادة بناء الصورة، وتحليل البيانات. كما تقدم اقتراحات بشأن كيفية تعديل البروتوكول لعينات مختلفة.

لم يتم تطبيق الأشعة المقطعية الدقيقة على نطاق واسع على اللافقاريات البحرية بسبب تنوعها في مورفولوجيا. طريقة لدينا تمكن من السهل تركيب العينات في أي زاوية مناسبة لmorphology لها. ويمكن أن يؤديها مع المواد المشتركة، مثل المياه والطين، وأنابيب، وإذا كان ذلك ممكنا، لعينات مع مجموعة متنوعة من الأشكال، من دودة طويلة إلى كرة مستديرة.

ومن بين الاجراءات اسيتيرو ماينو وهو فنى بالمعهد الوطنى للوراثة باليابان . للبدء، إعداد 0.5٪ agarose عن طريق حل 500 ملليغرام من agarose في 100 ملليلتر من الماء المقطر في قارورة مخروطية 250 ملليلتر، ووضع القارورة في ميكروويف في قوة 800 واط لتسخين حوالي 1-3 دقائق. يبرد القارورة في درجة حرارة الغرفة.

لتركيب عينات كبيرة لا تناسب في 1000 ميكرولتر الصغير تلميح الأزرق، مثل A.equina، أول مكان العينة الملون في طبق 60 ملليمتر مع الماء المقطر لغسل قبالة حل تلطيخ المفرط من السطح. في أنبوب 50 ملليلتر، صب بلطف خمسة ملليلتر من 0.5٪ agarose دون صنع فقاعات. ضع الأنبوب على الجليد لتصلب الأغاروز.

ثم إضافة 20 ملليلتر من 0.5٪ agarose إلى الأنبوب، ووضع على الجليد حتى يبدأ agarose لتصلب، واستخدام ملقط لوضع العينة داخل agarose. ضبط موضع العينة بحيث يكون محور الجسم العمودي. هاردن الأاروز على الجليد.

ضع الطين على مرحلة التركيب المجهرية وتعيين أنبوب 50 ملليلتر على الطين. لتركيب عينات صغيرة تناسب في 1000 ميكرولتر الصغير الأزرق تلميح, مثل Harmothoe sp. وX.japonica, decant العينة الملون في طبق 60 ملليمتر دون استخدام ملقط.

مع ملاقط حلقة، نقل بلطف العينات إلى طبق آخر 60 ملليمتر مليئة بالماء المقطر لغسل قبالة حل تلطيخ المفرط من السطح. المقبل، رسم 100 ميكروليتر من 0.5٪agarose في 1000 ميكرولتر تلميح الأزرق ووضعها على الجليد لتصلب. عند التعامل مع Harmothoe sp.

إضافة 1000 ميكروليتر من 0.5٪ agarose في المكونات agarose في تلميح. استخدم ملاقط الحلقة لنقل هارموثو بلطف من الطبق الذي 60 ملليمترًا إلى محلول agarose في الطرف.

مع إبرة صغيرة أو ملاقط الدقة، وضبط موقف واتجاه sp Harmothoe بحيث لا يتم عازمة chaetae بشكل غير طبيعي. تأكد من عدم وجود فقاعات، ومن ثم ضع الطرف على الجليد لتصلب agarose.

عند التعامل مع عينات هشة مثل X.japonica، استخدم ميكرويبيت لإضافة 1000 ميكرولترات من الماء المقطر في طرف الأزرق مع المكونات agarose تصلب. ضع X.Japonica في الماء المقطر بحيث يكون مستقرًا بين جدران الطرف. بالنسبة للعينات الأصغر، يمكن استخدام طرف أصفر صغير سعة 200 ميكرولتر.

في هذه الحالة، استخدم 30 ميكرولترات من agarose للمكونات، وإضافة 200 ميكرولترات من أغاروز أو الماء المقطر. بعد ذلك، قم بقطع طرف جديد، 1000 ميكرولتر الصغير الأزرق، وأدخل طرف تلميح موصول في طرف جديد. ضع الطين على مرحلة التركيب microCT وتعيين النصائح مع العينة داخل على الطين.

فورا بعد تركيب العينات، بدوره على شعاع الأشعة السينية في 80 كيلوفولت و 100 ميكرومبس. أثناء مراقبة صورة نقل الأشعة السينية، قم بتحريك المرحلة بحيث يمكن رؤية العينة بأكملها من خلال النقر على أزرار محور س و Z، وعن طريق ضبط مقبض المحور ص يدويًا على مرحلة التركيب. ضبط ظروف التباين للصورة بحيث يمكن ملاحظة الهياكل الداخلية.

ضبط اتجاه العينة عن طريق تغيير زاوية الأنبوب في الطين. تدوير المرحلة 90 درجة عن طريق تعيين محور الاستدارة إلى 90، والنقر على زر حركة النسبية. تنفيذ المناورة نفسها أربع مرات لإكمال دوران كامل.

قم بإيقاف تشغيل شعاع الأشعة السينية يدويًا في كل مرة يتم فيها فتح باب العينة، ما لم يكن النظام يقوم بإيقاف تشغيله تلقائيًا. الآن انقر على زر محور z وضبط يدويا مقبض المحور ص لنقل مرحلة التركيب بحيث العينة في مركز العرض. تحويل المرحلة بمقدار 90 درجة وضبط العينة إلى المركز مرة أخرى.

قم بتشغيل المرحلة 90 درجة ثلاث مرات أخرى، ثم قم بضبطها حسب الحاجة للتأكد من أن العينة في مركز العرض من كافة الاتجاهات. بعد ذلك، انقر على زر المحور س لتحريك المرحلة على طول المحور x نحو مصدر شعاع الأشعة السينية لتكبير العينة، وضبط حسب الحاجة بحيث تناسبها فقط في طريقة العرض. قم بتشغيل المرحلة ثم قم بضبطها حسب الحاجة للتأكد من أن العينة تناسبها في العرض من جميع الاتجاهات.

اضبط ظروف المسح الضوئي ثم ابدأ المسح الضوئي. في هذه التجربة، تم تنفيذ التصوير المجهري على أكينيا أكتينيا، Harmothoe sp. وXenoturbella japonica بعد تلطيخ مع حل 25٪ لوغول.

وقد نجح التلطيخ في تعزيز تباين الهياكل الداخلية في جميع العينات، مما مكن من رصد الأنسجة الرخوة الداخلية. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على العينات الهشة حتى مع الأضرار الخارجية، كما يمكن أن ينظر إليه من عينة X.japonica مع البشرة التالفة بشدة. وأعيد بناء مجموعة بيانات واحدة عالية الدقة من عينة كاملة لرموتيهو sp.

وX.japonica من عمليات مسح متعددة أجريت على أجزاء مختلفة ولكن متداخلة من العينة. تأكد من ضبط العينة في الأنبوب أو طرفك، ثم قم بتركيب الأنبوب أو طرف في ميكروك بحيث لا يتحرك أثناء المسح الضوئي. يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها من هذا الإجراء لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد، مما يمكن الباحث من فهم كامل لكل من المورفولوجيا الداخلية والخارجية للعينة.

جميع أنظمة microCT استخدام الأشعة السينية، ولكن قد تكون التفاصيل مختلفة من نظام واحد إلى آخر، لذا يرجى التأكد من اتباع تعليمات كل نظام عن كثب.