التحكم الكتلة الخلية الأولى 3D في جهاز مكعب جل هجين لتشكيلات نمط التكرار
March 21st, 2019
نحن نقدم إجراءات للتحكم في شكل كتلة الخلية الأولى في مصفوفة 3D خارج الخلية للحصول على تشكيل نمط تكرار. ويستخدم جهاز مكعب الذي يحتوي على اثنين من الهلاميات المائية المختلفة تحقيقا للتصوير المتعدد الاتجاهات لتشكيل نمط الأنسجة.
يستخدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتعزيز موثوقية نموذج ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد دون استخدام أي معدات خاصة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا إجراء تجربة الثقافة ثلاثية الأبعاد القابلة للتكرار من خلال التحكم في حالة الثقافة الأولية داخل الجهاز المكعب. بعد إعداد خمسة من خمسة ملليمتر البولي الإطار مكعب، ووضع الإطار على شريحة المبردة مسبقا وصندوق الثلج واستخدام ماصة لإضافة 12 ميكروليتر من 1.5٪ أكاروز مسخ من الوجه العلوي للإطار مكعب إلى السطح السفلي.
نشر agarose للحصول على سطح مستو والسماح للبوليمر لعلاج. استخدم الملاقط لشريحة الإطار إلى حافة الزجاج وتدوير الإطار بحيث يكون الجانب المفتوح مواجهًا لأسفل قبل إعادة وضع الإطار على الشريحة. بعد ملء السطحين التاليين من الإطار مع المزيد من agarose، كما أظهرت للتو، إسقاط agarose في وعاء من وجه مفتوح لتشكيل جدار agarose على الجانبين الرابع والخامس.
لإعداد شكل كتلة خلية أولية حقن مصفوفة الخلية المناسبة لثقافة الخلية من الفائدة في الفضاء ثقافة مكعب هلام الهجين وتعيين قالب صغير ملفقة على المكعب. ثم ضع المكعب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية. عندما يتم شفاء المصفوفة خارج الخلية، ورفع بعناية من العفن الصغير بحيث لا تتدهور المصفوفة.
وسيتم ملفقة جيب في شكل القالب المطلوب في مصفوفة خارج الخلية. لتحميل الخلايا تركيز تعليق الخلية التجريبية بعد الطرد المركزي في خلية مناسبة المتوسطة ثقافة التجريبية وحقن الخلايا في الجيب داخل مصفوفة خارج الخلية. ضع المكعب في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالوقوع في جيب المصفوفة خارج الخلية ، وملء المساحة التي تم إنشاؤها بواسطة القالب الصغير.
في نهاية الحضانة، ضع المكعب في بئر واحد من 24 بئراً وأضف 100 ميكرولترات من خلية مناسبة متوسطة لثقافة البئر. حقن مصفوفة إضافية خارج الخلية لإغلاق الجيب والعودة المكعب إلى الحاضنة لمدة 25 دقيقة. عندما يتم الشفاء من المصفوفة خارج الخلية قطرة ما يقرب من 10 ميكرولترات من 20 درجة مئوية agarose على السطح العلوي إلى المكعب لإغلاق السطح وعلاج قطرة لمدة 10 إلى 20 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ثم تغطية المكعب بأكمله مع المتوسطة الطازجة لتعزيز الضغط التناضح لتسهيل نقل التغذية إلى الخلايا داخل المكعب. بالنسبة للتعرف على الشكل ثلاثي الأبعاد غير الباضع بواسطة المراقبة متعددة الاتجاهات، ضع اللوحة على مرحلة المجهر واحصل على صور لكل جانب من المكعب بواسطة مجهري الحقول أو الطور الساطع، باستخدام ملاقط لتدوير خدمة المكعب ليتم تصويرها بين الالتقاطات. للتصوير المناعي من خلال المراقبة متعددة الاتجاهات، أولاً التبخر من البئر الذي يحتوي على المكعب وإصلاح المكعب في 4٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية التثبيت، وغسل المكعب مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل. Impermeabilize المكعب مع 0.5٪ triton x-100 وBBS لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل المكعب ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق لكل غسيل ، قبل حظر أي ارتباط غير محدد بمصل الماعز ومخزن المناعة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة وفقا لبروتوكولات تلطيخ الأجسام المضادة القياسية. ثم صورة جميع الاطراف الستة من المكعب على مجهر الليزر أو الفلورسنت كما أظهرت للتو. في هذه التجربة التمثيلية التصوير متعدد الاتجاهات من مكعبات هلام الهجين، المستزرعة مع الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية العادية، يوضح توليد الأولية أسطواني أو المنشور ثقافة الخلية على شكل المرحلة على النقيض من ذلك وتصوير المناعة الفلورية من الثقافات.
هنا تلطيخ مناعي من الخلايا الظهارية البشرية العادية التي تسيطر عليها في البداية إلى شكل أسطواني في مكعب هلام الهجين، بعد أن يظهر جيل من شجرة الشعب الهوائية. تظهر الفروع العمودي على المحور الأسطواني ، كما يكشف عن ذلك التصوير متعدد الأبعاد. من المهم حقن كثافة عالية من الخلايا في جيب المصفوفة خارج الخلية ، حيث أن الكثافة المنخفضة للخلايا قد تؤدي إلى تدهور جودة الخلايا بعد الحضانة.
هذا النمط الأسلوب هو تشكيل تكرار لنمط خلوي ثلاثي الأبعاد مع قياس كمي عن طريق التصوير متعدد الاتجاهات لدراسة آلية تطوير الطبق.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول طريقة للتحكم في الشكل الأولي لمجموعات الخلايا في مصفوفة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد، مما يسهل تكوين الأنماط المتكررة. باستخدام جهاز مكعب مع نوعين مختلفين من المواد الهلامية، تتيح التقنية التصوير متعدد الاتجاهات في تكوين أنماط الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- هندسة الأنسجة
الخلفية
- نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ضرورية لدراسة تطور الأنسجة.
- يمكن أن يؤدي التحكم في ظروف الثقافة الأولية إلى تعزيز موثوقية التجربة.
- تستخدم المواد الهلامية بشكل شائع في هندسة الأنسجة لتوافقها الحيوي.
- يوفر التصوير متعدد الاتجاهات رؤى شاملة حول تكوين الأنسجة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد بدون معدات متخصصة.
- تحقيق تكوين أنماط متسقة في مجموعات الخلايا.
- استخدام جهاز مكعب لقدرات تصوير محسنة.
الطرق المستخدمة
- إعداد إطار بولي كربونات مكعب لزراعة الخلايا.
- تطبيق أغاروس المسخنة مسبقًا لإنشاء سطح مستوٍ.
- التعبئة المتسلسلة للإطار المكعب بالأغاروس لتشكيل الجدران.
- استخدام الملقط للتلاعب الدقيق بالإطار.
النتائج الرئيسية
- إنشاء بيئة زراعة خلوية ثلاثية الأبعاد مستقرة بنجاح.
- ملاحظة تكوين أنماط متكررة في مجموعات الخلايا.
- استخدام فعال للمواد الهلامية للتصوير متعدد الاتجاهات.
- تعزيز موثوقية النتائج التجريبية في دراسات الأنسجة.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة نهجًا بسيطًا لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.
- التحكم في الظروف الأولية أمر بالغ الأهمية للتكرار.
- يمكن تطبيق هذه التقنية في العديد من تطبيقات هندسة الأنسجة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Reliable 3D cell culture models are critical for early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D, yet reproducibility remains a major barrier. This hybrid gel cube device enables precise control of initial cell cluster shape and density, directly addressing variability in pattern formation and supporting robust hypothesis testing. Enhanced repeatability in 3D cultures strengthens predictive confidence and informs portfolio triage at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of self-organization mechanisms by minimizing initial condition variability.
- Supports functional target validation through repeatable 3D pattern formation.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing controlled manipulation of cell cluster geometry.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized 3D biological systems for downstream screening workflows.
- Improves assay reproducibility by controlling cell density and spatial distribution in ECM.
- Enables quantitative imaging outputs for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant tissue architecture for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing robust, repeatable preclinical data.
- Facilitates biomarker discovery through high-resolution, multi-directional imaging.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and assay development, providing a foundation for lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Reduces experimental noise in hypothesis testing and pathway analysis by standardizing initial 3D culture conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for high-content analysis.
- Analytics: Enables multi-directional imaging and quantitative measurement of 3D pattern formation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by replicating tissue-like structures.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable platform for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D culture studies.
- Operational Value: Standardizes workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and ECM handling.
- Needs access to basic cell culture and imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of cell density and mold fabrication protocols.
- Adaptable to various cell types and ECM compositions with protocol optimization.
- Dependent on high cell density for optimal pattern fidelity and viability.
