عزل وإكثار بريون البروتين التعبير خلال تمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية لب الأسنان

الطريقة القياسية للحصول على الخلايا الجذعية من لب الأسنان غير فعالة، وهذا يعتمد على عدة متغير. بروتوكولنا يسمح بالحصول على عزل ناجح للخلايا الجذعية من الأسنان المعالجة في 90٪ من الحالات. الحصول على عدد كبير من الخلايا في غضون أسابيع قليلة هو الميزة الرئيسية.

وهذا يسمح لنا باستخدام الخلية في الطب التجديدي وإنشاء بنك حيوي يزود العلماء الآخرين بهذه الأداة المفيدة. سيتم إجراء عملية فتح الأسنان من قبل Dr.Constantino Santacroce. في وقت لاحق، سيتم عرض البروتوكول من قبل ستيفانو مارتيلوتشي، طالب الدكتوراه من مختبري، الذي هو المؤلف الأول للمقال.

للبدء ، استخراج الضرس الثالث من المريض ، وشطف بسرعة مع برنامج تلفزيوني ، ووضع في أنبوب اختبار 15 ملليلتر مع المتوسطة ، ونقله إلى المختبر في أقل من ساعتين. تحت غطاء محرك السيارة الخطر الحيوي، واستخدام القاطع لفتح الأسنان عن طريق تمريرة قطع الإكلال، موازية ومنعسة، من خلال سقف غرفة اللب. مع حفارة صغيرة، وإزالة بلطف اللب، ووضعها في أنبوب اختبار.

ثم، يغسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات، والطرد المركزي في 2،500 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي، إزالة ناطور. إعادة إنشاء بيليه في حل هانك، ونقل العينة إلى طبق بيتري.

إزالة الحل هانك عن طريق الطرد المركزي في 2،500 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم، مع مشرط المتاح، وتقسيم اللب إلى شرائح ما يقرب من ملليمتر واحد، وإضافة ملليلتر واحد من الكولاجين من النوع الرابع. بعد ذلك، الطرد المركزي العينة في 2،500 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.

إزالة ناظر، وإعادة تعليق بيليه في الوسط. زرع ذلك في قارورة T25 محددة للخلايا الجذعية في 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون 5٪. خلال فترة الحضانة، تغيير الوسط الثقافة كل ثلاثة أيام.

بمجرد أن تصل الخلايا الملتصِق إلى التقاء، أضف ملليلترًا واحدًا من محلول التربسين-EDTA إلى الخلايا لفصلها، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، أضف أربعة ملليلترات من الوسط الثقافي بنسبة واحد إلى خمسة لإيقاف عمل التربسين، والطرد المركزي تعليق الخلية عند 259 مرة ز لمدة ست دقائق. إزالة المناط.

ثم ضع الخلايا في قارورة T25 للنشر. ثم، فصل الخلايا مع ملليلتر واحد من التربسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. الطرد المركزي تعليق الخلية في 259 مرات ز لمدة ست دقائق.

إزالة supernatant، والمضي قدما لاختبار الخلايا لتحليل cytofluorimetric. لأداء خطوة إسكات البروتين البريون العابرة ، وثقافة الأولى الخلايا الجذعية لباب الأسنان البشري في لوحات ستة جيدا مع ملليلتر اثنين من المتوسطة الثقافة لمدة 24 ساعة. ثم، إضافة 400 ميكرولترات من التدخل الصغير الحمض النووي الريبي PrP المتوسطة لكل عينة، واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات.

دون تجاهل سيرنا PrP المتوسطة، إضافة 1.6 ملليلتر من المتوسطة الثقافة في نسبة واحد إلى خمسة، وترك الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة المابير ، وغسل الخلايا بمليلترين من PBS ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة ملليلترين من متوسطة الثقافة العصبية، والحفاظ على الخلايا لمدة سبعة إلى 14 يوما في حاضنة في 37 درجة مئوية.

بعد فترة الحضانة، وغسل الخلايا مع مليلترين من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة، والمضي قدما في تحليل لطخة الغربية لاختبار مستضدات سطح الخلايا العصبية. لأداء عملية تحريض الخلايا العصبية، ثقافة 2 مليون الخلايا الجذعية لب الأسنان الإنسان في لوحات ستة جيدا، تصل إلى 28 يوما من فصل اللب. كل ثلاثة أيام، تجاهل المُندفع.

غسل ثلاث مرات مع مليلترين من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة، واستبدال مليلترين من وسط ثقافة الخلايا العصبية. بعد سبعة إلى 14 يوما، فصل الخلايا مع ملليلتر واحد من التربسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم، إضافة أربعة ملليلتر من الوسيلة الثقافة في نسبة واحد إلى خمسة لوقف عمل التربسين.

لتوصيف الخلايا الجذعية لباب الأسنان البشري عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة، ثقافة 2 مليون لكل ملليلتر من الخلايا في لوحات ستة بئر مع مليلترين من المتوسطة الثقافة. في 28 يوما بعد فصل اللب الأسنان أو بعد 14 يوما إضافية مع متوسطة ثقافة الخلايا العصبية، إضافة ملليلتر واحد من التربسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لفصل الخلايا. بعد ذلك، أضف أربعة ملليلترات من الوسط الثقافي بنسبة واحد إلى خمسة لإيقاف عمل التربسين، و 259 ضعف درجة حرارة الغرفة لمدة ست دقائق.

إصلاح الخلايا غير المعالجة أو المعالجة مع 300 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، الطرد المركزي ، والتخلص من الفائق ، وpermeabilize الخلايا مع 1 ٪ غير الأيونية السطحي في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق إضافية. ثم، الطرد المركزي مرة أخرى، والتخلص من كبرى، وتنفيذ عرقلة مع الحليب المجفف غير دفت 5٪ في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

غسل ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا مع المضادة لـ CD105، ومكافحة CD44، ومكافحة- STRO-1، ومكافحة CD90، ومكافحة CD73، ومكافحة بيتا-ثلاثة-توبولين، ومكافحة NFH، ومضادة للأجسام المضادة لP-GAP43 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى ثلاث مرات متتالية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني على فترات لمدة ست دقائق ، ومن ثم احتضان مع PE المضادة للماوس أو المضادة للأرانب CY5 الأجسام المضادة أحادية النسيلة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إضافية واحدة. استخدم الأجسام المضادة الثانوية لسيتينغ الخلايا الإيجابية المناعية، وتحليل جميع العينات باستخدام مقياس تدفق الخلايا.

ثقافة 2 مليون خلية لكل ملليلتر من الخلايا الجذعية للب الأسنان البشري في لوحات ستة بئر مع ملليلترين من المتوسطة الثقافة. في 21 و 28 يوما بعد فصل اللب الأسنان أو بعد سبعة إلى 14 يوما إضافية مع متوسطة ثقافة الخلايا العصبية، إضافة ملليلتر واحد من التربسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لفصل الخلايا. ثم، الطرد المركزي، والتخلص من الماحتة، ومن ثم إصلاح العينات مع 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، الطرد المركزي ، والتخلص من الفائق ، ومن ثم permeabilize مع 1 ٪ غير الأيونية السطحي في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant، وصمة عار الخلايا مع أرنب المضادة لبرب الأجسام المضادة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وأخيرا، الطرد المركزي، والتخلص من supernatant، ومن ثم احتضان مع المضادة المضادة للأرانب CY5 أحادية النسيلة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إضافية.

تحليل جميع العينات مع جهاز قياس تدفق. بعد فصل اللب، تم توسيع مجموعات من الخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية على الأطراف. وأظهرت مقارنة بين نمو هذه الخلايا قبل وبعد التمايز العصبي الناجم عن EGF /bFGF تغييرات كبيرة في مورفولوجيا الخلية ونيوريات خارج النمو.

أعرب الإنسان غير المعالجة الخلايا الجذعية لب الأسنان متعددة القدرات مستضدات سطحية المحددة السحوقية ال ميسنشيمال، مثل CD44، CD90، CD105، CD73، وS STRO-1. بعد المحفزات التعريفية الخلايا العصبية المناسبة, وأعرب عن هذه الخلايا علامات خلايا عصبية محددة, مثل بيتا-ثلاثة-توبولين, NFH, و GAP43. ولم تُعبِّر الخلايا غير المعالجة أو المعالجة عن علامات تكسائية، مثل CD14 وCD19.

بعد 28 يوما، تم التعبير عن بروتين بريون بشكل مبكر في الخلايا الجذعية لب الأسنان الإنسان مقارنة مع السيطرة السلبية المقابلة، وزاد التعبير عنه بعد عملية التمايز العصبي الناجمة عن EGF/bFGF. أظهر تحليل البقعة الغربية أن إسكات بروتين البريون من قبل SRNA قبل محفزات EGF/bFGF يمكن أن تؤثر على عملية التمايز العصبي للخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية عن طريق منع التعبير عن علامات الخلايا العصبية بيتا-ثلاثة-توبولين وNHF. أهم شيء هو اختيار الإنزيم لفصل الخلايا عن اللب.

في الواقع، إذا كان الإنزيم عدوانيًا جدًا، فقد تتضرر الخلايا ويمكن أن تتعرض قدرتها على النمو والتمايز للخطر. الخلايا الجذعية لب الأسنان هي نموذج تجريبي ممتاز يمكن توظيفه في الدراسات الحية وفي المختبر في مجال الطب التجديدي. منذ PrP يلعب دورا رئيسيا في عملية التمايز العصبي للخلايا الجذعية لب الأسنان, قد يكون هذا علامة مرشح ممتاز كهدف فعال في الأمراض العصبية.

أهم جانب لتقديم المشورة هو الحالة الصحية للمرضى ، مثل عدم وجود الأمراض المعدية.