Name: الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: تعلم قياس نشاط سينثاز السيترات في نسيج ذبابة الفاكهة دون عزل الميتوكوندريا. هذه الطريقة السريعة تُستخدم لتقدير كتلة الميتوكوندريا السليمة في دراسات الأيض الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31401013 و 31471010) ، ولجنه العلوم والتكنولوجيا التابعة لبلديه شنغهاي ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (14PJ1405900) ، ومؤسسه العلوم الطبيعية التابعة شنغهاي (19ZR1446400).

1. القياس اللوني سيترات Synthase النشاط المقايسة ل d. الميلاغوجاستر16
<ol><li>جمع عشره الذباب الكبار لكل عينه. جمع علي الأقل عينات ثلاثية لكل النمط الجيني.</li>
	<li>اعداد 500 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة التي تحتوي علي 20 مم HEPES (pH = 7.2) ، 1 مم أدتا ، و 0.1 ٪ تريتون X-100 في أنبوب اختبار 1.5 mL لكل عينه.</li>
	<li>تخدير الكبار الذباب مع CO2 علي وساده التخدير وعزل الانسجه المطلوبة. لعزل الصدر ذبابه الكبار ، علي سبيل المثال ، إصلاح الصدر ذبابه من قبل زوج من الملقط ، ومن ثم عزل ذبابه بطون عن طريق قطع علي طول الحدود للصدر والبطن باستخدام زوج من المقص. جمع الصدر ذبابه لاختبار النشاط سيترات العضلات synthase. ملاحظه: تحديد الوزن الطازج من الانسجه في هذه الخطوة إذا استخدامه لتطبيع سيترات synthase النشاط.</li>
	<li>نقل 10 الكبار يطير الصدر إلى 100 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة علي الفور والتجانس مع مدقه علي الجليد. للحفاظ علي عينات الجليد الباردة ، والتجانس عينات ل 5-10 s علي الجليد ، ثم يكون عينات الجلوس علي الجليد لمده 5 ليالي ، وتكرار حتى جميع الانسجه في الأنبوب متجانسة تماما. ملاحظه: الشريط الأنبوب ، والتحقق من تجانس للتاكد من انه لا توجد جلطات في المتجانسات وان الانسجه في الأنبوب متجانسة تماما. وينبغي اجراء جميع العلاجات عينه علي الجليد.</li>
	<li>خذ 10 μL من كل عينه متجانسة في أنبوب جديد لقياس محتوي البروتين. الحفاظ علي عينات لقياس البروتين علي الجليد. ملاحظه: يمكن تجميد عينات البروتين وتخزينها في-80 درجه مئوية للتحليل في وقت لاحق. تركيزات البروتين بمثابه معلمه داخلية لتطبيع الانشطه synthase سيترات.</li>
	<li>أضافه 400 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة لكل عينه المتبقية لجعل حجم الكلي من 500 μL. اخلط جيدا عن طريق السحب بلطف صعودا وهبوطا 5x علي الأقل ، وتجنب تشكيل فقاعه. لكل رد فعل, أضافه 1 μl من الخلايا المخففة محلله إلى 150 μl من حل رد فعل أعدت حديثا (20 مم تريس-HCl (pH 8.0), 0.1 mm dtnb, 0.3 مم اسيتيل CoA, 1 مم حمض اوكسالواستيك). تخلط جيدا وعلي الفور عن طريق الأنابيب بلطف ، وتجنب تشكيل فقاعه. قياس الامتصاص في 412 nm كل 10-30 s ل 4 دقيقه عند 25 درجه مئوية باستخدام قارئ لوحه قادره علي قياس الامتصاص في 412 nm علي فترات الحد الأدنى من 10 s. ملاحظه: تغيير غيض قبل الأنابيب كاشف مختلفه وتجنب تشكيل فقاعات في الآبار. خلط غير مكتملة من الكواشف قد يسبب اختلافات في القياسات. وينبغي ان يتم فحص النشاط سينثاز سيترات في درجه حرارة الغرفة مباشره بعد جمع العينات ، كما يتم استخدام هذا الفحص لقياس كتله الميتوكوندريا سليمه. يجب اعداد المخزن المؤقت للتفاعل مباشره قبل الاستخدام ويجب عدم تخزينه.</li>
	<li>بيانات الرسم كامتصاص الكثافة البصرية (OD) (abs) (المحور ص) مقابل الوقت (بالدقائق) (المحور س). ثم يحسب الميل للجزء الخطي من المنحني ، حيث معدل التفاعل هو <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq1.jpg"> تقسم القيمة حسب تركيز البروتين العينة لتطبيع نشاط synthase سيترات. يتم احتساب نشاط synthase سيترات كما <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq2.jpg"> ملاحظه: يمكن قياس تركيز البروتين العينة بواسطة مجموعه فحص تركيز البروتين.</li>
</ol>

<ol><li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells%3A+The+Discerning+Killers%21%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!</a> Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).</li>
<li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals%3A+Untangling+the+knot%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li>
<li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%2C+oxidative+stress%2C+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death & Disease. 5, e984(2014).</li>
<li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li>
<li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate+synthase%3A+structure%2C+control%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li>
<li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
<li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel%2FdPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).</li>
<li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spargel%2FdPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li>
<li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster%3A+oxidative+stress%2C+mitochondrial+activity%2C+and+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li>
</ol>

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

يجب ان تاخذ الدراسات الايضيه التي تستخدم دروفيسيلا كنموذج في الاعتبار الخلفية الوراثية ، والنظام الغذائي ، وصيانة المخزون من الذباب18. لتجنب اثار الخلفيات الوراثية المختلفة علي قياس النشاط synthase سيترات ، يجب ان تكون السلالات المختلفة من دروكوفيلا إلى سلاله السيطرة لمده 10 أجيال. الخلفية الجينية لجميع سلالات دروفيا المستخدمة في تجاربنا هي w1118، لذلك استخدمنا w1118 كعنصر تحكم. عموما ، ونحن نعتقد w1118 هو الس...

الميتوكوندريا هي المعروفة باسم العضوية المنتجة للطاقة في معظم الكائنات الحية النواة ، والتي تنتج العملة الطاقة ، ATP ، من خلال دوره حمض تريكاربوكسيليك (اي ، دوره كريبس) والاكسده فوسفولات. ووجدت الميتوكوندريا أيضا للعب ادوار هامه في الكثير من العمليات الفسيولوجية الأخرى, مثل تنظيم المبرمج1, Ca2 + التوازن2,3, أنواع الاكسده التفاعلية (ROS) جيل4, والشبكية إندوبلازمي (ER)-استجابه الإجهاد5. الخلل الميتوكوندريا يمكن ان تؤثر علي اي عضو في الجسم في اي عمر وهو السبب الرئيسي لاستقلاب, الشيخوخة المرتبطة6, وامراض الأعصاب7. الميتوكوندريا سليمه ذات الصلة ميكانيكيه إلى وظيفة الميتوكوندريا. التالي, التحديد الكمي السليم للكتلة الميتوكوندريا سليمه مهم جدا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا8. Synthase سيترات, انزيم الحد من معدل في الخطوة الاولي من دوره حمض تريكاربوكسيليك9, مترجمه في مصفوفة الميتوكوندريا داخل الخلايا النواة, التالي يمكن استخدامها كعلامة كميه لوجود كتله الميتوكوندريا سليمه9,10. سيترات synthase النشاط يمكن أيضا ان تستخدم كعامل تطبيع للبروتينات الميتوكوندريا سليمه11,12.
ذبابه الفاكهة ، دروكوفيلا ميلغاستر، هو نظام نموذجي ممتاز لدراسة وظيفة الميتوكوندريا ، كما العديد من الجزيئات والمسارات التي تلعب دورا محوريا في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها تطوريا من دروفيبيلا إلى البشر13،14،15. هنا ، نقدم بروتوكولا لطريقه سريعة وبسيطه لقياس النشاط synthase سيترات بواسطة فحص الملونة في الانسجه دروفيا المتجانسات16 في شكل لوحه جيد 96. في اختبار النشاط سينثاز سيترات ، synthase سيترات في الانسجه المتجانسة في دروفيسيلا يحفز رد فعل اوكسالوخلات مع انزيم اسيتيل A (اسيتيل coa) لتشكيل سيترات COA-SH وH +. CoA-SH يتفاعل لاحقا مع 5 ، 5 '-dithiobis-(2-حمض نيتروبنزويك) (DTNB) لتوليد منتج ملون ، 2-نيترو-5-ثيوبنزواتي (TNB) ، والتي يمكن قياسها بسهوله فوتومتر في 412 nm. يمكن ان ينعكس نشاط synthase سيترات بمعدل إنتاج ألوان.

<table><tbody><tr><td>2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيل] حمض الإيثان سلفونيك (HEPES)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>2-أمينو -2- (هيدروكسي ميثيل) -1،3-بروبانديول (قاعدة تريزاما)</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>أسيتيل CoA</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>حمض ديثيو بيس نيتروبنزويك (DTNB)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>أوكسالو أسيتات</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>بيليه مدقة</td><td>سانجون</td><td>F619072</td><td></td></tr><tr><td>بيليه مدقة محرك</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y10</td><td></td></tr><tr><td>قارئ لوحة</td><td>BioTek</td><td>Eon</td><td></td></tr><tr><td>Protein BCA مجموعة الفحص</td><td>Beyotime</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>مقص</td><td>WPI</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon</td><td>A110694-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

الميتوكوندريا تلعب الأدوار الأكثر بروزا في الأيض الخلوية عن طريق إنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده وتنظيم مجموعه متنوعة من العمليات الفسيولوجية. خلل الميتوكوندريا هو السبب الرئيسي لعدد من الامراض الايضيه والعصبية. الميتوكوندريا سليمه هي حاسمه لأداءها السليم. يتم تعريب سيترات الانزيم synthase في مصفوفة الميتوكوندريا التالي يمكن استخدامها كعلامة انزيم الكمية من كتله الميتوكوندريا سليمه. النظر إلى ان العديد من الجزيئات والمسارات التي لها وظائف هامه في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين البشر و دروفيسيلا، وان هناك مجموعه من الاداات الجينية القوية متوفرة في دروفيا، فان دروفيسيلا تعمل كنظام نموذجي جيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لقياس سريع وبسيط من النشاط synthase سيترات في المتجانسات الانسجه من الذباب الكبار دون عزل الميتوكوندريا. هذا البروتوكول هو أيضا مناسبه لقياس النشاط synthase سيترات في اليرقات, الخلايا المستزرعة, وانسجه الثدييات.

ويقدم الشكل 1 مثالا علي المنحنيات الحركية لامتصاص التردد الOD عند 412 نانومتر بمرور الوقت الذي تم الحصول عليه باستخدام الفحص اللوني لنشاط السيترات سيترات لقياس انسجه الصدر الصدرية المتجانسة لمختلف الأنماط الجينية. ومن المعروف جيدا ان PGC-1α هو منظم رئيسي لنشاه الميتوكوندريا الحيوية. يتم الحفاظ علي PGC-1α من الناحية الوظيفية بين دروفيا والبشر. دروفيا RNF34 (dRNF34) هو E3 اوبيكييتين ليتاز لل دروفيبيلا pgc-1Α ، dpgc-1 ، ويعزز ...

نحن نقدم بروتوكولا لفحص ألوان من النشاط synthase سيترات للقياس الكمي من كتله الميتوكوندريا سليمه في الانسجه المتجانسة .

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila بمثابة نظام نموذج جيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا. هنا نقدم بروتوكول لقياس نشاط citrate synthase في تجانس الأنسجة من الذباب الكبار. لا يتطلب هذا البروتوكول عزل الميتوكوندريا.وهو سريع وبسيط ومناسب لقياس نشاط سيترات سينثاز في اليرقات والخلايا المستزرعة والأنسجة الثديية. ابدأ بجمع الذباب البالغ لكل عينة، مع التأكد من جمع عينات ثلاثية على الأقل لكل نمط جيني. إعداد 500 ميكرولتردات من الجليد الباردة استخراج العازلة مع 20 ملليمتر HEPES، واحد ملليمولار EDTA، و 0.1٪ triton X-100 في أنبوب اختبار 1.5 ملليلتر لكل عينة.تخدير الذباب البالغ مع ثاني أكسيد الكربون على وسادة التخدير. لعزل الصدر، وإصلاحها مع زوج من ملقط وعزل البطن ذبابة عن طريق قطع على طول الحدود من الصدر والبطن مع زوج من مقص. جمع thoraxes ذبابة لcitrate synthase النشاط المقايسة.نقل 10 الكبار تطير الصدر إلى 100 ميكرولترات من الجليد الباردة استخراج العازلة على الفور وتجانس لهم مع آفة على الجليد. الحفاظ على العينات الباردة عن طريق التجانس لمدة خمس إلى 10 ثوان على الجليد، والسماح لهم الجلوس على الجليد لمدة خمس ثوان، ثم تكرار حتى يتم تجانس جميع الأنسجة تماما. Aliquot 10 ميكرولترات من كل عينة متجانسة إلى أنبوب جديد لقياس محتوى البروتين ، والحفاظ على هذه الأنابيب على الجليد كذلك.إضافة 400 ميكرولتردات من الجليد الباردة استخراج العازلة لكل عينة المتبقية لحجم إجمالي 500 ميكرولترس وماصات صعودا وهبوطا بلطف لخلط. لكل رد فعل، إضافة ميكرولتر واحد من الخلايا المخففة إلى 150 ميكرولترات من حل رد الفعل الطازجة. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف، مع التأكد من تجنب تشكيل فقاعة، ثم استخدام قارئ لوحة لقياس امتصاص في 412 نانومتر كل 10 إلى 30 ثانية لمدة أربع دقائق في 25 درجة مئوية.رسم البيانات على أنها امتصاص على مر الزمن، ثم حساب الميل للجزء الخطي من المنحنى. وأخيراً، قم بتقسيم معدل التفاعل أو المنحدر حسب تركيز البروتين العينة لتطبيع نشاط سيترات سينثاز. كان من المفترض أن الضربة القاضية من dRNF34 في العضلات Drosophila من شأنه أن يزيد من نشاط سينثاز سيتايثاز الميتوكوندريت في حين أن الضربة القاضية من dPGC-1 من شأنه أن يعكس هذه الزيادة.تم تحديد معدل انزيمي خطي أولي لكل مقايسة؛ تمثل منحدرات خطوط الاتجاه معدلات التفاعل القصوى التي تعادل أنشطة سينتاناز السيترات القصوى للنمط الجيني المختلف. تم حساب أنشطة سينثاز سيترات القصوى من المنحنيات الحركية وتم تطبيعها حسب تركيز البروتين. وأظهرت النتائج أن نشاط synthase من الصدر يطير في الواقع زيادة مع العضلات الخاصة dRNF34 الضربة القاضية والزيادة انعكست عن طريق ضربة قاضية dPGC-1 العضلات المحددة.عند تجانس العينة ، من المهم أن تقلب الأنبوب وتتحقق من التجانس للتأكد من عدم وجود جلطات وأن الأنسجة في الأنبوب متجانسة تمامًا. بعد جمع العينات، يجب إجراء جميع العلاجات العينة على الجليد. يتم استخدام مقايسة نشاط سينثاز سيترات لتحديد كتلة الميتوكوندريا سليمة.يعد القياس الكمي السليم للكتلة الميتوكوندريا السليمة مهمًا جدًا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا.

a-colorimetric-assay-citrate-synthase-activity-drosophila

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو وراثيا وسلوكيا نظام نموذج قابل للطرق التي استخدمت لفهم الأساس الجزيئي والخلوي من العديد من العمليات البيولوجية الهامة لأكثر من قرن 1. ذبابة الفاكهة قد تم استغلالها بشكل جيد للحصول على نظرة ثاقبة الأساس الجيني للسلوك الذباب.

طرق الفحص ذبابة الفاكهة سلوك

يصف هذا الفيديو مقايسة لونية لقياس مقايسة نشاط سينسيز سترات الميتوكوندريا الموجودة في تجانس الأنسجة ذبابة الفاكهة.

مقايسة نشاط سينسيز السترات: اختبار لوني لقياس نشاط سينسيز سترات الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الأنسجة المتجانسة

إدخال جزيئات صغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين تقدم إمكانية كبيرة للتميز النشاط البيولوجي لمركبات جديدة، والمخدرات، والسموم، وكذلك لبحث مسارات التنموية الأساسية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة الخطوط العريضة الخطوات التي تغلب على الحواجز الطبيعية لهذا النهج، وتوسيع المنفعة من طراز الجنين ذبابة الفاكهة.

A طريقة Permeabilization من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر

تصف هذه الورقة طريقة لقياس أكسدة الوقود في ذبابة الفاكهة السوداء التي يتم فيها تغذية كميات ضئيلة من ركائز التمثيل الغذائي المحددة ذات العلامات الإشعاعية للذبابة. يتم جمع وقياس الزفير ذو التصنيف الراديويCO2 الناتج عن أكسدة الوقود.

قياس إنتاج ثاني أكسيد الكربون من رديولبلد ركائز في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

اختبار CApillary FEeder (CAFE) هو طريقة بسيطة وصديقة للميزانية وموثوقة للغاية للتحقيق في الآليات الكامنة وراء تناول الطعام. يستخدم مع الكائن الحي النموذجي الجيني متعدد الاستخدامات ذبابة الفاكهة السوداء ، ويوفر وسيلة قوية لاكتساب رؤى جديدة حول الآليات التنظيمية لتناول الطعام.

الشعيرات الدموية المغذية الفحص يقيس كمية الطعام في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

يمكن تقييم النقل أيون الخلوية غالباً عن طريق مراقبة درجة الحموضة داخل الخلايا (الأس الهيدروجينيأنا). وراثيا مرمز الأس الهيدروجيني-المؤشرات (جيفيس) توفر الكمي البصري لدرجة الحموضة داخل الخلايا في الخلايا سليمة. تفاصيل هذا البروتوكول التحديد الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا عن طريق الخلوي السابقين فيفو العيش-التصوير للأنابيب مالباييان من melanogaster المورفولوجية مع فري، زائفة-راتيوميتريك وراثيا ترميز مؤشر الرقم الهيدروجيني.

الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة التعرف على يرقات melanogaster المورفولوجية التي تعاني من نقص تحت مستويات الأوكسجين الغلاف الجوي العادي. ويسمح هذا البروتوكول اليرقات التاكسج ينبغي تمييز من طفرات أخرى تظهر متداخلة تعمل مثل الركود أو بطء النمو.

"مقايسة" Burrowing/النفقي "الكشف عن نقص" في اليرقات melanogaster المورفولوجية

ويرد في هذه الورقة، طريقة لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس بيرميبيليزيد من المورفولوجية. هذا الأسلوب يتطلب مقداراً قليلاً من الأنسجة مقارنة بتقنية عزل المتقدرية الكلاسيكية وما تحقق من النتائج ذات صلة أكثر فسيولوجيا.

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

نقدم بروتوكولا لقياس استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية في العقول melanogaster المورفولوجية اليرقات والكبار. ويستخدم هو محلل ايضية مع بروتوكولا مدروسا والأمثل. القيود الأنسجة الدقيقة هي عنصر حاسم لهذا البروتوكول وصممت وأنشئت خصيصا لاستخدامها في هذا التحليل.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

ويصف هذا البروتوكول مقايسة المجراة في البلعمه في الكبار melanogaster المورفولوجية التحديد الكمي للاعتراف بلعمية وتخليصها من العدوى الميكروبية.

تقييم الاستجابة المناعية الخلوية ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، استخدام "في فيفو البلعمه بالانزيم"

قياس التنفس بقياس الكولوم مثالي لقياس معدل الأيض للكائنات الحية الدقيقة. عند تكييفه مع ذبابة الفاكهة الميلانية في الدراسة الحالية ، كان استهلاك O2 المقاس ضمن النطاق الذي تم الإبلاغ عنه للنوع البري D. melanogaster من خلال الدراسات السابقة. كان استهلاك O2 لكل ذبابة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر حجما وأقل نشاطا ، أقل بكثير من النوع البري.

قياس استهلاك O2 في ذبابة الفاكهة الميلانية باستخدام قياس التنفس المجهري بقياس الكولوم

تعلم قياس نشاط سينثاز السيترات في نسيج ذبابة الفاكهة دون عزل الميتوكوندريا. هذه الطريقة السريعة تُستخدم لتقدير كتلة الميتوكوندريا السليمة في دراسات الأيض الخلوي.

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

استكشف المزيد من الفيديوهات