طريقة استخراج متعددة Omics للتحليل المتعمق للثقافات المتزامنة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii

والدراسات التي تجري على نطاق المنظومة حاسمة في فهم الوظائف البيولوجية فهما عميقا. ومع ذلك، هناك حاجة إلى عينات مستقلة متعددة لمنصات omics مختلفة، وإدخال كمية عالية من التباين في البيانات. هذه الطريقة تقدم استراتيجية قوية وعالية الإنتاجية لاستخراج في وقت واحد من الكلورو, الدهون, المستقلبات, البروتينات, والنشا من عينة واحدة من النغا الخضراء نموذج, chlamydomonas reinhardtii.

بالنسبة لاستخراج الكلوروفير، والدهون، والاستقلاب، قم بترتيب أنابيب كريات خلايا Chlamydomonas المحصودة في النيتروجين السائل. Resuspend بيليه في كل أنبوب مع ملليلتر واحد من 20 درجة استخراج العازلة واحد. لتجنب تبخر العازلة استخراج اللزوجة منخفضة، دوامة بسرعة الأنابيب حتى يتم تجانس الخلايا بشكل جيد داخل خليط استخراج و aliquot الحل في اثنين من أنابيب microcentuge ملليلتر.

سونيكات الثقافات في حمام سونيكيشن في الماء البارد الجليد لمدة 10 دقائق قبل الحضانة على شاكر المدارية في 1، 000 التناوب في الدقيقة لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة 650 ميكرولترات من استخراج العازلة اثنين ودوامة لفترة وجيزة العينات قبل الطرد المركزي. إلى aliquot الكسور، نقل 500 ميكرولترات من مرحلة الدهون MTBE العليا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر المسمى.

استخدام ماصة 200 ميكرولتر لإزالة مرحلة الدهون ونقل 650 ميكرولتردات من المرحلة المنخفضة القطبية وشبه القطبية المستقلب في أنابيب جديدة تحمل علامة. استلهم حجم الفائض لإزالة المرحلة الأقل المتبقية وتجميد الكريات الصلبة في النيتروجين السائل للتخزين 80 درجة. لتحديد المستقلب القطبي، resuspend بيليه المجففة من المرحلة القطبية في محلول هيدروكلوريد ميثوكسيمين البيريدين للميثوكسيمين من المجموعات الكربونية وتسخين العينات في 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.

في نهاية الحضانة، اشتقاق العينات مع n-ميثيل-n-trifluoracetamide لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية وفقا للبروتوكولات القياسية. استخدام الكروماتوغرافيا الغاز إلى جانب وقت الطيران الطيفية الكتلة لتحليل الأيض الأولية. لتحديد المستقلب غير القطبية، resuspend بيليه المجففة من المرحلة غير القطبية في خليط من سبعة إلى ثلاثة حجم لحجم الأسيتونيتريل إلى isopropanol والرواسب الكريات عن طريق الطرد المركزي.

ثم فصل العينات على عمود C8 المرحلة العكسية على نظام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء. لتحديد محتوى الكلوروفيرل، مزيج 100 ميكرولترات من المرحلة MTBE مع 900 ميكرولترات من 90٪ الميثانول لطريقة فارغة فضلا عن العينات التجريبية. ثم قياس الامتصاص على مقياس الطيفي في 655 و 652 نانومتر أطوال موجية للتمييز بين الكلوروفيرل ب والكلوروفير وحساب محتوى الكلوروفيرل أ وب ومحتوى الكلوروفير الكلي.

لاستخراج البروتين، حل بيليه المرحلة السفلى في 200 ميكرولترات من العازلة البروتين واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينة ونقل السوبر المحتوية على البروتين إلى أنبوب جديد. قياس تركيز البروتين باستخدام فحص برادفورد.

وهضم البروتين، قلل 15 ميكروغراماً من العينة في خمسة ديوثيوثيريتول ميليمولار لمدة 30 دقيقة، تليها الألكيل مع 10 ملليمولاري iodoacetamide لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. في نهاية الألكيل، مزيج تريبسين / ليس-C حل في نسبة البروتين 25 إلى واحد إلى البروتياز واحتضان العينة لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. تمييع العينة ستة أضعاف في 50 ملليمولار تريس Hcl لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، إنهاء الهضم مع حمض ثلاثي الفلوراستيك إلى تركيز نهائي من 0.5 إلى 1 ٪ بعد الهضم ، والتركيز على العينات إلى قرب الجفاف ، وترك اثنين إلى خمسة ميكرولترات من الحل في فراغ المكثف دون تدفئة. إعادة تعليق العينة في مخزن التحميل المؤقت. تحليل خليط الببتيد بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتل باستخدام مقياس الطيف كتلة عالية الدقة متصلة نظام الكروماتوغرافيا السائلة ضغط متناهية الصغر نانو.

لفصل الببتيدات، تحميل أربعة ميكرولترات من العينة على 20 سم عكس المرحلة المشحونة عمود هجين سطح مع قطر داخلي من 75 ميكرومتر وحجم جسيم من 1.7 ميكرومتر. استخدام إعدادات غير متصلة حلقة جزئية مع التدرج متساوي المستويات تعيين في 3٪ من المخزن المؤقت B، عقد لمدة 14 دقيقة قبل أن يتم إزاحة الحلقة إلى موضع عبر الإنترنت مع العمود، وبعد ذلك سيتم زيادة التدرج خطياً لمدة 50 دقيقة حتى يتم الوصول إلى 20٪ المخزن المؤقت B. ويمكن ملاحظة تحول في حجم الخلية حيث تنمو الخلايا في حجمها طوال مرحلة الضوء ، يليها إطلاق الخلايا الابنة بدءًا من نهاية مرحلة الضوء من 10 ساعات.

بمجرد أن يتم تحرير جميع الخلايا ابنة، يمكن ملاحظة تحول في حجم الخلية، كما يتم التخلص من الخلايا ابنة صدر حديثا لبدء الدورة القادمة. استناداً إلى تحليل قياس الطيف الكتلي الكتلي للكسر القطبي، في هذه التجربة التمثيلية، تم إضافة 65 من نواتج الأيض. أدى تحليل قياس الطيف الكتلي الكتلي اللوني السائل للمرحلة المحايدة المحتوية على الدهون إلى تحديد 204 نوع من الدهون المتميزة تغطي مختلف فئات الدهون.

يمكن استخدام التحليل الرئيسي للمكونات لتصور التحولات العالمية في الأيض والدهون عبر دورة الخلية مع فصل مراحل الضوء والظلام وكذلك المراحل شبه الدورية التي لوحظت لكل من بيانات المستقلبومومية والدهون. هنا، يتم عرض لمحة عامة عن الإثراء الوظيفي لل 2،463 البروتينات المخصبة التي تم تحديدها. ويمكن استخدام الكريه المتبقية بعد استخراج البروتين في القياس الكمي المستنسخ للنشا ، كما هو مبين في الانحراف المعياري المنخفض بين مختلف التكرارات.

من المهم تجنب تجفيف المرحلة العضوية العليا من الكلورو فيل، لأن هذا يمكن أن يؤثر على مستويات الكلورو في المذيبات، مما يؤثر على عامل التطبيع للعينات. يمكن تنفيذ إجراءات تحليلية مختلفة للتوصيف الكيميائي الحيوي للأنواع الجزيئية المستخرجة.