تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه
أبريل 11, 2019
أوبينبروت هي قاعدة بيانات يمكن الوصول إليها بحرية يفرض نموذجا بوليسيسترونيك الجينومات حقيقية النواة. نقدم هنا، على بروتوكول لاستخدام قواعد البيانات أوبينبروت عند استجواب datasets الكتلي. أوبينبروت باستخدام قاعدة البيانات لتحليل التجارب البروتين يسمح باكتشاف الرواية والبروتينات يمكن الكشف عنها سابقا.
OpenProt هي قاعدة البيانات الأولى التي تسمح بشرح متعدد الويكتروني للجينومات eukaryotic ، تعترف إمكانات الترميز من الجينات بروتو وتمكن من اكتشاف البروتينات التي لم يتم الكشف عنها من قبل. لقد صممنا هذا البروتوكول بحيث يكون في متناول جميع المستخدمين دون الحاجة إلى مهارات حيوية واسعة يضع أساسا الاكتشافات البروتيومية في متناول أي شخص. لفهم ومعالجة التحديات الحالية في الطب، نحن بحاجة إلى فهم كامل للمشهد البروتيومي وجميع الجهات الفاعلة وديناميكيتها.
OpenProt يوفر هذا الاحتمال. على الرغم من أن هنا، يستخدم OpenProt لتحليل التجارب الزبونومية، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم مع أنظمة أخرى كما أنها ببساطة توفر تعريفا أكثر وضوحا من البروتيوم. ابدأ بفتح موقع OpenProt واستخدام الرابط من قائمة الصفحة العليا لفتح صفحة التنزيلات.
انقر على الأنواع ذات الاهتمام بناء على بيانات التحليلات التجريبية ونوع البروتين المطلوب. انقر فوق AllProts، Isoforms و RefProds لتوليد الملفات التي تحتوي على جميع أنواع البروتين المعروفة والرواية الموجودة في قاعدة بيانات OpenProt وإذا كان ذلك متاحا، انقر على الشرح الذي يتم رسمه تسلسل البروتين. انقر على مستوى الأدلة الداعمة اللازمة للنظر البروتين وفقا لهدف البحث.
ثم انقر فوق، كل المتوقع أن تولد الملفات التي تحتوي على جميع توقعات OpenProt وانقر فوق تنسيق الملف المطلوب لتحميل. بالنسبة إلى الأنايز البروتيومية، حدد ملف بروتين FASTA. سوف يحتوي الملف التمهيدي على كافة المعلومات الضرورية على تنسيق الملف.
لمعالجة قاعدة البيانات، قم بتسجيل الدخول إلى مثيل أداة proteomics المناسبة وإنشاء محفوظات جديدة. لاستيراد قاعدة بيانات OpenProt التي تم تنزيلها، انقر فوق تحميل. لإدخال سير عمل معالجة قاعدة البيانات، انتقل إلى صفحة سير العمل، وانقر فوق تحميل مرة أخرى وانقر فوق تشغيل سير العمل.
ثم حدد قاعدة بيانات OpenProt المستوردة كمدخل وإعادة تسمية الملف Fasta التي تم الحصول عليها إلى شيء ذي معنى. قاعدة البيانات جاهزة للاستخدام في تحليلات البروتيوميات. لإعداد ملف قياس الطيف الشامل، افتح أداة تحويل MS المتوفرة مجانًا من مجموعة المعالج proteo وتحميل ملف البيانات ليتم تحليله.
حدد الدليل لإخراج وتعيين تنسيق الملف المطلوب إلى mzML ثم استخدام خوارزمية الموجة على أساس مستويات الطيف الشامل واحد واثنين لتحديد مرشح التقاط الذروة وبدء التحويل. بالنسبة إلى كمي البروتين، قم بإنشاء تاريخ جديد واسحب وإسقاط قاعدة البيانات التي تم إنشاؤها سابقًا في التاريخ الجديد. انقر فوق تحميل لاستيراد ملف بيانات mzML المحولة.
افتح صفحة سير العمل، وانقر فوق تحميل مرة أخرى لاستيراد سير العمل المطلوب، وحدد تشغيل سير العمل لمراجعة المعلمات المختلفة. حدد ملف البيانات mzML المستوردة وإدخال قاعدة البيانات التي تم إنشاؤها مسبقاً كملف Fasta قاعدة البيانات. منذ سير العمل يستخدم X!
جنبا إلى جنب محرك البحث، انقر فوق تحميل لاستيراد X! ملف التكوين الافتراضي جنبا إلى جنب. لحساب الزيادة الكبيرة في الحجم عند استخدام البيانات OpenProt كله استخدام معدل اكتشاف كاذبة صارمة.
لمراقبة الجودة، قم بتشغيل أداة معلومات الملف على مخرجات مرشح المعرّف لتوفير مقاييس مشتركة للأداء، مثل عدد مطابقة طيف الببتيد أو عدد الببتيدات والبروتينات التي تم تحديدها. بالنسبة لتعدين قاعدة بيانات OpenProt، ارجع إلى موقع OpenProt على الويب وافتح صفحة البحث. انقر على الأنواع ذات الأهمية التي تم تحديد البروتين لها وأدخل رقم الانضمام إلى البروتين في مربع الاستعلام عن البروتين.
انقر فوق زيادة جدول يحتوي على معلومات أساسية للبروتين الاستعلام سوف تظهر. بعد ذلك، انقر فوق ارتباط التفاصيل. ستحتوي الصفحة التي تم فتحها حديثًا على متصفح الجينوم الذي يتمحور حول البروتين المُكَلَم، بالإضافة إلى معلومات أخرى.
للحصول على تسلسل البروتين أو الحمض النووي، انقر فوق وصلات البروتين أو الحمض النووي من علامات التبويب المعلومات، على التوالي ثم انقر فوق علامات التبويب لتصفح المعلومات التفصيلية حول الكشف عن التنميط الريبوسوم الريبوسي الشامل، والحفاظ على وتحديد مجالات البروتين. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تحديد معظم البروتينات المحددة في الورقة الأصلية أيضًا باستخدام 2_pep OpenProt أو قاعدة بيانات OpenProt_all ، مما يظهر أن قواعد بيانات OpenProt قادرة على إنتاج تحديد البروتين وتحديد كمي مماثل لتلك الإجراءات الحالية استنادًا إلى قواعد بيانات InterPro KB. تم تحديد 11 بروتينًا مدعومًا جيدًا لم يتم بعد مشروحة في قواعد البيانات عبر جميع مجموعات البيانات باستخدام ببتيدات واثقة باستخدام قاعدة بيانات OpenProt 2_pep.
تم اكتشاف 29 بروتينًا جديدًا عبر جميع مجموعات البيانات باستخدام الببتيدات الواثقة باستخدام قاعدة بيانات OpenProt_all. لم يؤثر معدل الاكتشاف الزائف الصارم الموصى به على أكثر عمليات تحديد البروتين ثقة، على الرغم من أنه انخفض العدد الإجمالي للبروتينات المحددة. تم اكتشاف بروتين جديد واحد كمتفاعل لبروتين Raf-1.
ولم يسبق الكشف عن هذه البروتينات بواسطة قياس الطيف الكتلي أو التنميط الريبوزومي وأظهرت طيفاً جيداً. تذكر أن تضمن أن المعلمات المختارة كافية للتصميم التجريبي وتحقق دائمًا من جودة الأدلة الرياضية عند الإبلاغ عن اكتشافات البروتين الجديدة. هذا البروتوكول قابل للتكيف مع جميع التجارب البروتيوميات من أعلى إلى أسفل لا سيما عند استخدامها مع بروتيوميات وظيفية.
وهذا سيسمح بكثير من الفحص العميق وفهم التفاعلات البروتين والمسارات الخلوية. يسلط OpenProt الضوء على التقليل الكبير من المناظر الطبيعية البروتومية التي نقلتها السجلات الجينومية الحالية ويؤكد على الطبيعة البولي كترونيك للجينات eukaryotic. إنه طريق جديد تماما للبحث.
جمال هذا البروتوكول هو أنه لا يتطلب مهارات حيوية واسعة النطاق وأنه منذ أن يستخدم خوادم بعيدة، فإنه يمكن تشغيلها على أي جهاز كمبيوتر.
نظرة عامة
OpenProt هي قاعدة بيانات رائدة تدعم نموذج متعدد الحمض النووي الريبي لجينومات حقيقيات النوى، مما يسهل اكتشاف البروتينات التي لم يكن بالإمكان كشفها من قبل. يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام قواعد بيانات OpenProt لتحليل مجموعات بيانات مطيافية الكتلة، مما يجعل اكتشافات البروتينات في متناول الباحثين دون مهارات حيوية حاسبية متقدمة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم البروتينات
- علم الجينوم
- المعلوماتية الحيوية
الخلفية
- يتيح OpenProt التعليق التوضيحي المتعدد الحمض النووي الريبي لجينومات حقيقيات النوى.
- يتعرف على الإمكانات الترميزية للبروتينات الأولية.
- تعزز قاعدة البيانات فهم المناظر الطبيعية للبروتين.
- توفر تعريفًا أوضح للبروتين لتحليلات مختلفة.
غرض الدراسة
- تقديم بروتوكول لاستخدام OpenProt في التحليلات البروتينية.
- تمكين تحديد البروتينات الجديدة من خلال مطيافية الكتلة.
- جعل التحليل البروتيني في متناول المستخدمين ذوي مستويات الخبرة المختلفة.
الطرق المستخدمة
- الوصول إلى قاعدة بيانات OpenProt واختيار الأنواع محل الاهتمام.
- تنزيل ملفات البروتين بتنسيقات مختلفة للتحليل.
- استخدام أداة تحويل MS لإعداد بيانات مطيافية الكتلة.
- استخدام تدفقات العمل لتحديد وكميّة البروتين.
النتائج الرئيسية
- تحديد 29 بروتينًا جديدًا و11 بروتينًا مدعومًا جيدًا لم يتم تمييزها من قبل.
- تبيين تحديد البروتينات بشكل قابل للمقارنة مع قواعد البيانات الحالية.
- تسليط الضوء على نقص تقدير المناظر الطبيعية للبروتين من خلال التعليقات التوضيحية الجينومية الحالية.
- أظهر أن البروتوكول قابل للتكيف مع تجارب البروتينات المختلفة.
الاستنتاجات
- يعزز OpenProt بشكل كبير اكتشاف البروتينات في جينومات حقيقيات النوى.
- البروتوكول سهل الاستخدام ولا يتطلب مهارات حيوية حاسبية متقدمة.
- يفتح أبوابًا جديدة للبحث في علم البروتينات والدراسات الوظيفية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Current genome annotations underestimate the eukaryotic proteome by imposing arbitrary ORF length and single-ORF-per-transcript constraints, limiting target discovery in early drug development. OpenProt addresses this gap by enabling polycistronic annotation, revealing novel proteins from non-canonical ORFs that may represent underexplored therapeutic targets or off-liability risks. This expands the target validation landscape and improves predictive confidence in preclinical target selection by reducing false negatives in proteomic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins translated from non-coding regions, 5'/3' UTRs, or overlapping CDSs, clarifying proteome complexity.
- Operational Value: Supports functional target validation through detection of novel proteins with mass spectrometry evidence, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by uncovering proteins with potential disease relevance, improving confidence in target prioritization decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by providing comprehensive protein sequence databases that reflect the true proteomic landscape.
- Operational Value: Improves assay standardization and reproducibility through use of species-specific, evidence-tiered OpenProt databases in mass spectrometry workflows.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by reducing false negatives in proteomic screens via expanded search space with appropriate FDR controls.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by identifying novel proteins expressed in models used for preclinical validation, linking discovery to functional outcomes.
- Mechanistic De-risking: Facilitates biomarker alignment by detecting proteins with conserved domains or interaction profiles, such as the Raf-1 interactor, enabling pathway-level validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing proteins missed in conventional annotations, reducing late-stage biological surprises.
Pipeline & Workflow Integration
OpenProt integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, enhancing proteome-wide screening with minimal bioinformatics overhead.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying proteins from non-canonical ORFs that may modulate disease-relevant signaling networks.
- Screening: Enhances assay readiness and quantitative output reliability by enabling comprehensive database searches with controlled FDR, improving detection of low-abundance or novel targets.
- Analytics: Generates peptide spectrum matches, protein identification, and quantification data that allow cross-condition comparison and target validation.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by identifying proteins with conservation, domain architecture, or interaction evidence relevant to human biology.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic knowledge base across species and projects, reducing redundant database curation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing the polycistronic nature of eukaryotic genes and reducing false negatives in proteomic discovery.
- Operational Value: Promotes standardization and scalability through freely accessible, species-specific protein databases compatible with mainstream proteomics tools.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of high-confidence novel targets, reducing investment in false leads.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by expanding the target space with evidence-based novel proteins, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires basic proteomics expertise in mass spectrometry data handling and database searching, though no advanced bioinformatics skills are needed.
- Necessitates access to proteomics tools capable of importing FASTA databases and running search engines like X!Tandem with custom workflows.
- Demands cross-team standardization on FDR thresholds and database versions (e.g., OpenProt_all vs OpenProt_2_pep) to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations when applying the database to non-model organisms or specialized sample types, guided by evidence level selection.
- Includes practical limitations such as increased database size requiring stringent FDR settings to maintain identification confidence, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
OpenProt Database Download
1:53
Database Handling
2:41
Mass Spectrometry File Preparation
3:13
Protein Quantification
4:13
Quality Control and OpenProt Database Mining
5:25
Results: Representative Interactor and Mass Spectrometry Identification of a Novel Protein
6:40
Conclusion
