توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

SEC-MALS هو طريقة كمية لتحديد الوزن الجزيئي والحجم والتكين للجزيئات الكبيرة في الحل. ويمكن أن يحدد القلة والمجمعات، وتميز العينات الصعبة، مثل بروتينات الغليكوس وبروينات الغشاء. SEC-MALS هو أسلوب مطلق.

وهو يعتمد على الفيزياء الأساسية، ولا يعتمد على التعاون ضد المعايير الجزيئية، أو تركيب الجزيء، أو كيفية تفاعلنا مع وسيط الفصل. SEC-MALS يمكن تطبيقها على العديد من الأنظمة التي يتم فصلها بواسطة ثانية. من الببتيدات والبوليمرات الصغيرة إلى البروتينات والنيوكلوباسيدات والبوليسريدات والبوليمرات الاصطناعية والجسيمات الشبيهة بالفيروسات والفيروسات الصغيرة.

من المهم التحقق من أن النظام والمخازن المؤقتة لا توجد توصيات المورد لمحتوى الجسيمات المنخفضة. استشر ممثل الدعم الفني للبائع للتأكد. ابدأ هذا الإجراء بإعداد نظام SEC-MALS كما هو موضح في بروتوكول النص.

باستخدام كل الكواشف PLC الصف، وإعداد لتر واحد من المالحة الفوسفات المخزنة مع 50 إلى 100 ملليمولار كلوريد الصوديوم. تصفية المخزن المؤقت إلى 0.1 ميكرون باستخدام مرشح رغوة الخلية المتعددة المعبأة في زجاجات، أو ما شابه ذلك. تصفية أول 50 إلى 100 ملليلتر من العازلة إلى زجاجة نفايات من أجل القضاء على الجسيمات من المرشحات الجافة.

ثم، تصفية ما تبقى إلى زجاجة نظيفة، العقيمة التي تم غسلها سابقا مع تصفية، والمياه غير المؤينة وأبقى لمنع الغبار من الدخول. مسح العمود بين عشية وضحاها بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لتكبيل العمود في المخزن المؤقت وإزالة الجسيمات. استخدم وضع التدفق المستمر لـ FPLC وتأكد من عدم توقف التدفق حتى تكتمل كافة عمليات تشغيل SEC-MALS.

ضع خلية تدفق DRI في وضع التطهير أثناء تدفق الليل. عند بدء تدفق، تدريجيا المنحدر معدل التدفق لمنع تأثير سفك العمود، الناجمة عن تغيير مفاجئ للضغط في العمود. قم بإيقاف عملية التطهير قبل بدء تشغيل النموذج.

تحقق من نظافة النظام عن طريق النقر بخفة على أنابيب المصب من العمود لإطلاق الجسيمات المتراكمة. مراقبة الإشارة في كاشف 90 درجة على شاشة اللوحة الأمامية لأداة MALS. تحقق من أن الضوضاء من الذروة إلى الذروة لا تزيد عن 50-100 ميكروفولت.

كذلك تحقق من أن مؤشر الانكسار، أو إشارة RI، مستقر إلى أقل من 1x0x إلى وحدات معامل الانكسار السبعة السالبة. إجراء حقن فارغة للتحقق من أن حاقن نظيف من الجسيمات. وفارغة هو ببساطة المخزن المؤقت قيد التشغيل المعدة في قارورة جديدة وعقيمة.

إذا كانت ذروة الجسيمات لا تزيد عن ملليلتر واحد في الحجم، ولا يزيد عن خمسة ملليفولت فوق خط الأساس، فإن النظام جاهز للعينات. وإلا، قم بإجراء حقن فارغة إضافية حتى تنظيف، أو إجراء الصيانة لتنظيف حاقن. الآن، إعداد ما لا يقل عن 200 ميكرولترات من BSA في واحد إلى اثنين ملليغرام لكل ملليلتر في المخزن المؤقت SCC.

تصفية البروتين إلى 02 ميكرون، وذلك باستخدام مرشح تلميح حقنة. تخلص من القطرات القليلة الأولى من الترشيحات ، من أجل القضاء على الجسيمات من المرشحات الجافة. بدلا من ذلك، الطرد المركزي العينة في 10،000 مرات G لمدة خمس عشرة دقيقة لتمكين هطول الأمطار من المجاميع غير القابلة للذوبان وغيرها من الجسيمات الكبيرة.

ثم، حقن 100 ميكرولترات من حل BSA في الحلقة. افتح تجربة جديدة من الأسلوب في قائمة برامج قانون إدارة البرامج. ثم حدد الأسلوب عبر الإنترنت من ضوء تشتت نظام الأساليب مجلد.

إذا كان كاشف DLS موجودًا، حدد الأسلوب عبر الإنترنت من تشتت الضوء مع مجلد QELS. تعيين معلمات نموذج ومرحلة المحمول في قسم التكوين. في عرض مضخة عام تعيين معدل التدفق إلى المستخدمة في FPLC.

ثم انتقل إلى عرض مضخة عامة، فرع المذيبات، حقل اسم، وحدد برنامج تلفزيوني. في طريقة العرض injector، نموذج الفرع، أدخل الاسم كـ BSA. تعيين dn / dc إلى 0.185، تعيين A2 إلى 0، وتعيين معامل انقراض الأشعة فوق البنفسجية إلى 0.667 ملليلتر لكل سنتيمتر مليغرام.

في المقطع الإجراءات، عرض المجموعة الأساسية، حدد مشغل مربع الاختيار على إدخال تلقائي. تعيين مدة التشغيل إلى 70 دقيقة، بحيث يتم تجميع البيانات للتلميحات بأكملها، حتى يتم الوصول إلى إجمالي حجم تغلغل عمود SEC. ابدأ التجربة في برنامج "إدارة مكافحة المخالفات" (MALS) بالنقر على زر التشغيل.

وسيبدأ في قراءة البيانات بعد تلقي إشارة النبض من جهاز FPLC عبر كاشف نظام إدارة الانبعاثات والإيدز. صفر إشارة DRI بالنقر على زر الصفر التلقائي على اللوحة الأمامية للصك. العمل في برنامج FPLC، انتقل إلى دليل، وتنفيذ التعليمات اليدوية، ووضع علامة، وإدراج اسم البروتين والمدى.

تبديل صمام الحقن من الحمل اليدوي لحقن، تحت مسار التدفق، صمام الحقن. قم بتضمين إشارة نبضة عن طريق إدخال نبضة ثانية 0.5 تحت نبضة مربع IO رقمي. سيؤدي ذلك إلى جمع البيانات في برنامج إدارة خدمات الـ MALS.

الآن، حقن العينة في الحلقة. انقر فوق تنفيذ في برنامج FPLC لبدء تشغيل التجربة. تنفيذ التحليل خطوة بخطوة، تحت قسم الإجراءات في برنامج قانون إدارة العمليات.

تحقق من أن القمم تظهر في نفس حجم التلميحات تقريباً في الأشعة فوق البنفسجية و MALS و RI بواسطة التحقق من عرض المجموعة الأساسية. في عرض خط الأساس، حدد خط الأساس لكافة الإشارات. في عرض القمم، حدد القمم التي سيتم تحليلها بالنقر على الماوس وسحبه.

حدد 50٪ المركزية من كل ذروة. أولاً حدد ذروة مونومر، ثم ذروة الديمر. تحت كل ذروة، تحقق من القيم الصحيحة لل dn/dc ومعامل الانقراض عند 280 نانومتر لـ BSA.

في الإجراءات، عرض المحاذاة، حدد المنطقة الوسطى من القمم بالنقر فوق وسحب الماوس. انقر فوق محاذاة الإشارات، ثم حسنا. في الإجراءات، عرض توسيع النطاق، واختيار المركزية 50٪ من ذروة مونومر.

تأكد من تحديد جهاز الكشف عن معامل الانكسار كأداة مرجعية. ثم انقر فوق أداء تناسب، وتطبيق لمطابقة الأشعة فوق البنفسجية وإشارات تشتت الضوء إلى إشارة معامل الانكسار. تكبير القمم للتحقق من أنها تتداخل بشكل وثيق جدا داخل وسط 50 إلى 70٪ ثم انقر فوق حسنا.

في الإجراءات، طريقة عرض التهيئة، حدد الذروة واحد. أدخل نانومتر 3.0 كقيمة RG، انقر فوق تسوية، ثم انقر فوق موافق. عرض الرسم البياني للنتائج في طريقة عرض الرسم البياني EASI.

حدد الكتلة الولية من القائمة المنسدلة في أعلى النافذة. استخدم عنصر التحكم، وانقر فوق، واسحب للتكبير إلى منطقة الذروة. لعرض نتائج الكتلة المولية النهائية التي تم جدولتها للمتوسط في الوزن للقمم الأحادية والمترية، انتقل إلى ذروة النتائج، لحظات الكتلة الضروس، MW، وحدد النتائج، ملخص التقرير.

يتم الإبلاغ عن النقاء تحت نتائج الذروة، جزء الكتلة. من قائمة الملفات، حدد حفظ كطريقة، وحفظ بيانات BSA المحللة كأسلوب قياسي للقياسات المستقبلية لجميع أنواع البروتينات. وسيتم ترحيل بارامترات التطبيع وتوسيع النطاقات المحددة بالنسبة لـ BSA في التحليل.

يظهر هنا تحليلات SEC-MALS لـ BSA، باستخدام عمود استبعاد حجم المسام 200 Angstrom. يتم تطبيع آثار الكروماتوغرام إلى ذروة مونومر، وتعويض للوضوح. ويشار إلى القطع الأثرية الشائعة التي يمكن تجاهلها، بما في ذلك ذروة الجسيمات قرب بداية إشارة تشتت الضوء، وكذلك قمم الملح والهواء المذاب بالقرب من حجم التغلغل الكلي في إشارة مؤشر الانكسار.

الكروماتوغرام معارض ممتازة monomer-dimer-trimer الفصل، وإشارة تشتت الضوء يسلك إشارة عالية إلى الضوضاء. متوسط متوسط الوزن المُونمر والمتوسط المولّي للقيم المولية يحملان تجانسًا عاليًا. وفيما يلي أمثلة على تحليلات لجنة الأوراق المالية والبورصة -قانون إدارة الشؤون المالية المنخفضة.

في هذا المثال، يؤدي فصل غير كاف على 75 Angstrom المسام حجم العمود استبعاد في ذروة الجسيمات بين ثماني إلى تسع دقائق، التي لا يتم فصلها بشكل جيد من البروتينات. هنا، هناك إشارة غير كافية إلى نسبة الضوضاء، والجسيمات واسعة المتاخمة للبروتينات واضحة في إشارة نثر الضوء. مفاتيح جيدة نتائج لجنة الأوراق المالية والبورصة - قانون الإدارة العامة هي اختيار عمود مناسب ، وضمان أن يتم معايرة النظام مع انخفاض الضوضاء تشتت الضوء ، وتصفية مسبقة أو الطرد المركزي للعينات لإزالة الجسيمات.

بعد SEC-MALS، يمكن تحليل عينات البروتين لمزيد من التقارب ملزمة، بيوليزا، الرنين البلازمون السطحية، قياس حراري متساوي الحراري، قياس الفيومات الحيوية، الحرارة الدقيقة، أو التدرج التكوين، متعددة الزاوية ضوء التشتت. ويمكن تحديد بنية البروتين بواسطة التصوير البلوري بالأشعة السينية، أو التنظير المجهري للإلكترونات المبردة، أو NMR.