Name: استخدام كريسبر / Cas9 لضرب جنرال موتورز-CSF في خلايا CAR-T (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: تعلم تعديل خلايا CAR-T وراثياً باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 أثناء التصنيع لإنتاج علاج أكثر فعالية وأقل سمية. يتيح هذا البروتوكول دمج الإنتاج والتعديل الجيني في خطوة واحدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال منح من K12CA090628 (SSK)، والشبكة الوطنية الشاملة للسرطان (SSK)، ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK)، ومؤسسة بريدولين (SSK)، ومكتب مايو كلينيك للترجمة إلى الممارسة (SSK)، و برنامج تدريب العلماء الطبيين في Mayo Clinic (مايو كلينك) روبرت ل. هاويل من المنح الدراسية للأطباء والعلماء (RMS).

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية في Mayo Clinic (مايو كلينك) واللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية (IBC).
1. CART19 إنتاج الخلايا
<ol><li>عزل الخلايا T، والتحفيز، وثقافة الجسم الحي السابق<ol>
<li>تنفيذ جميع أعمال ثقافة الخلية في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. حصاد خلايا الدم المحيطية أحادية النووية (PBMCs) من المخاريط الدم المتبرعة الطبيعية التي تم جمعها أثناء النعوت حيث من المعروف أنها مصدر قابل للحياة من مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم.
</li>
		<li>لعزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم، أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب فصل متدرج بكثافة 50 مل. تمييع دم المتبرع بكمية متساوية من المحلول على السالين المُسَوَّر بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على مصل البقر الجنيني (FBS) بنسبة 2% لتجنب احتجاز الخلايا.<ol>
<li>إضافة الدم المانح المخفف من المخروط في أنبوب الفصل، والحرص على عدم إزعاج واجهة بين الدم وكثافة التدرج المتوسطة. الطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 10 دقائق في RT.</li>
			<li>Decant supernatant في مخروطي جديد 50 مل، وغسل مع PBS + 2٪ FBS عن طريق جلب ما يصل إلى 40 مل، الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 8 دقائق في RT، يستنشق supernatant، إعادة تعليق في 40 مل من العازلة، وخلايا العد.</li>
		</ol>
</li>
		<li>عزل الخلايا T من PBMCs عن طريق مجموعة حبة المغناطيسي اختيار سلبي باستخدام فاصل الخلية مؤتمتة بالكامل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.</li>
		<li>لثقافة الخلايا T المعزولة، وإعداد T خلية المتوسطة (TCM) التي تتكون من 10٪ مصل AB الإنسان (v/v)، 1٪ البنسلين-ستريبوميسين-الجلوتامين (V / V)، والمصل خالية من مصل خلية المكونة للدم المتوسطة. تعقيم المتوسط عن طريق تصفية من خلال فلتر فراغ معقمة 0.45 م ومن ثم مع فلتر فراغ معقمة 0.22 م.</li>
		<li>في اليوم 0 (يوم تحفيز الخلايا T)، وغسل الخرز CD3/CD28 قبل تحفيز الخلايا T. لغسل، وضع الحجم المطلوب من الخرز (استخدام ما يكفي من الخرز CD3/CD28 لنسبة 3:1 حبات: T الخلايا؛ لاحظ تركيز الخرز يمكن أن يكون متغير) في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل معقمة وإعادة تعليق في 1 مل من TCM.</li>
		<li>مكان في اتصال مع المغناطيس.</li>
		<li>بعد 1 دقيقة، يستنشق TCM ويعلق في 1 مل من TCM الطازجة لغسل الخرز.</li>
		<li>كرر هذا الإجراء لما مجموعه ثلاث عمليات النفاية.</li>
		<li>بعد الغسيل الثالث، إعادة تعليق الخرز في 1 مل من TCM.</li>
		<li>عد الخلايا T.</li>
		<li>نقل الخرز إلى الخلايا T بنسبة 3:1 الخرز: الخلايا.</li>
		<li>تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من 1 × 106 خلايا / مل.</li>
		<li>حضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.</li>
	</ol></li>
	<li>T خلية التغوط والتحويل<ol>
<li>القيام بأعمال اللاتفيروسي باستخدام الاحتياطات BSL-2+، بما في ذلك أغطية زراعة الخلايا، ومعدات الحماية الشخصية، وتطهير المواد المستخدمة مع التبييض قبل التخلص منها.</li>
		<li>الحصول على بناء CART19 في ناقلات لينتيفيروسي. ملاحظة: تم تصميم بناء CART19 المستخدمة هنا ثم توليفها دي نوفو باستخدام بائع توليف البروتين المتاحة تجاريا. وقد استنسخت بناء CAR في وقت لاحق إلى الجيل الثالث من فيروس لينتي تحت سيطرة المروج EF-1α. يتم اشتقاق جزء المنطقة المتغيرة سلسلة واحدة من استنساخ FMC63 ويعترف CD19 الإنسان. تمتلك شركة CAR19 الجيل الثاني من مجال المحفزات المشتركة 4-1BB والتحفيز CD3י (FMC63-41BBz). 12
</li>
		<li>أداء إنتاج اللاتينفيروسي كما هو موضح سابقا. 12<ol>
<li>باختصار، لإنتاج لينتيفيروس، استخدم الخلايا 293T التي وصلت إلى 70-90٪ من الملاءمة.</li>
			<li>السماح بالحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من الكوارف عبر التغوط بما في ذلك 15 ميكروغرام من بلازميد لينتيفيروسي من الفائدة، 18 ميكروغرام من الكمامة / pol / tat / rev ناقلات التعبئة والتغليف، 7 ميكروغرام من ناقلات المغلف VSV-G، 111 ميكرولتر من الكاشف قبل المعقدة، 129 ميكرولتر من كاشف الانف، و 9.0 مل من وسيط الانف قبل إضافة إلى خلايا 293T. ثم ثقافة الخلايا المتحولة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.</li>
			<li>الحصاد، الطرد المركزي (900 × ز لمدة 10 دقائق)، فلتر (0.45 ميكرومتر مرشح النايلون)، والتركيز supernatant في 24 و 48 ساعة عن طريق ultracentrifugation إما 13،028 × ز لمدة 18 ساعة أو 112،700 × ز لمدة 2 ساعة.</li>
			<li>تجميد عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.</li>
		</ol>
</li>
		<li>في اليوم الأول، إعادة تعليق الخلايا T بلطف لتفريق ورديات الخلايا T التي تم تحفيزها في 1 × 106/مل في اليوم 0.</li>
		<li>في إطار الاحتياطات المناسبة BSL-2+ لجميع الأعمال اللينفيروسية، إضافة فيروس حصاد هاد جديد أو مجمد إلى الخلايا T حفز في تعدد العدوى (MOI) من 3.0.</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T توسيع الخلية<ol>
<li>خلال مرحلة التوسع، ومواصلة احتضان الخلايا T المستحثة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. عد خلايا CAR-T في اليومين 3 و 5، وإضافة جديدة، قبل تسخين TCM إلى الثقافة للحفاظ على تركيز خلية CAR-T من 1 × 106/مل.</li>
		<li>إزالة الخرز من الخلايا T المستحثة 6 أيام بعد التحفيز (اليوم 6) باستخدام المغناطيس. حصاد، وإعادة تعليق، ووضع الخلايا T في أنابيب مخروطية 50 مل في المغناطيس لمدة 1 دقيقة. ثم جمع supernatant (يحتوي على خلايا CAR-T)، وتجاهل الخرز.</li>
		<li>وضع الخلايا CAR-T التي تم جمعها مرة أخرى في الثقافة بتركيز 1 × 106 خلايا / مل لاستئناف التوسع.</li>
		<li>في اليوم 6، تقييم التعبير السطحي للسيارة عن طريق قياس التدفق. ملاحظة: يمكن استخدام عدة طرق للكشف عن التعبير السطحي للسيارة، مثل تلطيخ مع الماعز المضادة للماوس IgG (H + L) عبر المازيتاالأجسام المضادة الثانوية أو عن طريق تلطيخ مع الببتيد CD19 محددة، مترافقة مع فلوروكروم. هنا، خذ aliquot (حوالي 100،000 خلايا T) من الثقافة وغسل مع العازلة تدفق أعدت مع المالحة دولبيكو الفوسفات المخزنة، 2٪ مصل البقر الجنيني، و 1٪ أزيد الصوديوم. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة للجمهورية وغسل مرتين. وصمة عار الخلايا مع وصمة عار الحية / الميتة وCD3 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (OKT3). اغسل الخلايا ثم قم بإعادة الإيقاف المؤقت للتدفق. الحصول على مقياس السيتومتر لتحديد كفاءة التحويل.</li>
	</ol></li>
	<li>الحفاظ على الخلايا CAR-T بالتبريد<ol>
<li>لحصاد والبرد خلايا CAR-T بعد 8 أيام من التحفيز (اليوم 8 من توسيع الخلية T)، حصاد الخلايا من الثقافة.</li>
		<li>تدور إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 300 × ز.</li>
		<li>إعادة تعليق في تجميد المتوسطة في 10 مليون خلية لكل مل لكل قارورة في تجميد المتوسطة تتكون من 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 90٪ مصل البقر الجنيني.</li>
		<li>تجميد في حاوية التجميد لتحقيق معدل التبريد من -1 درجة مئوية / دقيقة في الفريزر -80 درجة مئوية ومن ثم نقل إلى النيتروجين السائل بعد 48 ساعة.</li>
		<li>قبل استخدامها في المختبر أو في التجارب الحية، ذوبان خلايا CAR-T في TCM الدافئة.</li>
		<li>غسل الخلايا لتخفيف وإزالة كبريتيد ثنائي الميثيل وإعادة تعليق إلى تركيز 2 × 106 خلايا / مل في TCM الدافئة. الراحة بين عشية وضحاها في37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.</li>
	</ol></li>
</ol>2- إنتاج GM-CSF k/o CART19
<ol><li>لتعطيل GM-CSF، استخدم دليل RNA (gRNA) يستهدف exon 3 من الإنسان GM-CSF (CSF2) التي تم اختيارها عن طريق فحص gRNAs التي ذكرت سابقا أن لديها كفاءة عالية لجين CSF2 الذي يرمز للسيتوكين البشري GM-CSF. 14 سنة ملاحظة: تم استخدام درجة بحث مركبة تجارياً Cas9 الجيل الثالث من البناء اللين الذي يحتوي على هذا gRNA (تحت مروج U6). يحتوي البناء على جين مقاومة البورومسين. التسلسل من ال [غرنا] [ككتكلتكتككّكّكّ]. 12
</li>
	<li>لإنتاج فيروس لينتي، استخدم الخلايا 293T التي وصلت إلى 70-90٪ الملاءمة.</li>
	<li>السماح بـ 15 ميكروغرام من بلازميد اللانيفي للفائدة، و18 ميكروغرام من ناقل التعبئة والتغليف الهفوة/pol/tat/rev، و7 ميكروغرام من ناقل مغلف VSV-G، و111 ميكرولتر من الكاشف قبل التفكيك، و129 ميكرولتر من كاشف الانتراب، و9.0 مل من وسيلة التغوط للحضانة لمدة 30 دقيقة في الغرفة te mperature.</li>
	<li>إضافة الكواشف transfection إلى خلايا 293T. ثم الثقافة في 37 درجةمئوية، 5٪ CO 2.</li>
	<li>الحصاد، الطرد المركزي (900 × ز لمدة 10 دقائق)، فلتر (0.45 ميكرومتر مرشح النايلون) والتركيز supernatant في 24 و 48 ساعة عن طريق ultracentrifugation إما 13،028 × ز لمدة 18 ساعة أو 112،700 × ز لمدة 2 ساعة وتجميد في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.</li>
	<li>في اليوم الأول، إعادة تعليق الخلايا T بلطف لتفريق الورود.</li>
	<li>في مختبر معتمد BSL-2+ ، إضافة فيروس المجمدة أو حصادها حديثا إلى الخلايا T حفز لتوليد خلايا CAR-T. خلايا T Transduce مع كل من CAR19 lentivirus وGM-CSF استهداف فيروس لينتي كريسبر. إضافة CAR19 lentivirus في وزارة الداخلية من 3. وبما أن معايرة فيروس لينتي كريسبر لم يكن ممكناً، استخدم جزيئات الفيروس المتولدة عن إعداد بلازميد 15 ميكروغرام لتبديل 10 x 106 خلايا T.</li>
	<li>راجع الخطوات المتبقية من تحفيز الخلايا T، والتوسع، والحفظ بالتبريد كما نوقش في الخطوة 1.
</li>
	<li>للخلايا T تحريرlentiCRISPR تحمل مقاومة البورومسين، علاج الخلايا مع ثنائي هيدروكلوريد البورومسين بتركيز 1 ميكروغرام من البورومسين لكل 1 مل في اليوم 3 واليوم 5 .</li>
</ol>3 - كفاءة تعطيل اللجنة العالمية للبلدان العالمية ولجنة دعم الأوراق المالية والتقييم الوظيفي لـ GM-CSF k/o CART19
<ol><li>كفاءة تعطيل GM-CSF: تتبع الإندلات عن طريق التحلل (TIDE) التسلسل والتحليل<ol>
<li>لتسلسل exon من الاهتمام في الجينات GM-CSF، استخدم التمهيديات التالية. استخدام تسلسل التمهيدي إلى الأمام لGM-CSF (CSF2) من TGACTACAGAGAGGCACAGA، وتسلسل التمهيدي العكسي من TCACCTCTGACCTCATTAACC.</li>
		<li>استخراج الحمض النووي من ما يصل إلى 5 ملايين خلايا CAR-T مع مجموعة استخراج الجينوم. لتفاعل PCR، استخدم 25 ميكرولتر من إتقان التقوى لكل رد فعل مع تركيز نهائي لكل التمهيدي في تفاعل PCR من μM، 0.1-0.5 ميكروغرام من الحمض النووي القالب، والحجم الإجمالي لرد فعل PCR جلبت ما يصل إلى 50 ميكرولتر مع المياه الخالية من nuclease.</li>
		<li>انظر شروط ركوب الدراجات PCR الموضحة في الجدول 1.</li>
		<li>تشغيل عينات PCR على هلام أجاروز 1-2٪ في 100 V لمدة 30 دقيقة واستخراج باستخدام مجموعة استخراج هلام.</li>
		<li>تسلسل PCR أمبوليكون. حساب تردد تعديل allele عن طريق تحميل البيانات الخام في برنامج TIDE المناسبة. 15
</li>
	</ol>
</li>
	<li>إنتاج صندوق الأمم المتحدة للإدارة الفنية ولجنة التنمية المستدامة والتقييم الوظيفي لـ GM-CSFk/o CART19<ol>
<li>لتحديد إنتاج السيتوكين من خلايا CAR-T، واحتضان خلايا CART19 من النوع البري وGM-CSFk/o CART19 مع CD19 التي تعبر عن خط الخلايا اللوكيميا اللمفاوية الحادNAL6 بنسبة 1:5 ل4 ح عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في وجود monensin حل، CD49d المضادة للإنسان، CD28 المضادة للإنسان، وCD107a المضادة للإنسان.</li>
		<li>حصاد الخلايا من الثقافة لتدفق قياس الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام مخزن قياس الخلايا. وصمة عار الخلايا مع مجموعة تلطيخ الحية / الميتة. الحضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>بعد الغسيل، وصمة عار الخلايا داخل الخلايا مع نفاذية المتوسطة في تركيبة مع الأجسام المضادة للبشرية IFNγ أحادية النسيلة، ومكافحة الإنسان GM-CSF، ومكافحة الإنسان MIP-1β، ومكافحة الإنسان IL-2، وCD3 المضادة للإنسان واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 الحد الأدنى غسل وإعادة تعليق العينات. الحصول على عينات على مقياس السيتومتر تدفق وتحليلها بالنسبة المئوية للتعبير داخل الخلايا GM-CSF.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK هو مخترع على براءات الاختراع في مجال العلاج CAR T-الخلية التي تم ترخيصها لNovartis (بموجب اتفاق بين Mayo Clinic ، جامعة بنسلفانيا ، ونوفارتي). تم تمويل هذه الدراسات جزئيا من منحة من Humanigen (SSK). RMS، MJC، RS، وSSK هي المخترعين على براءات الاختراع المتعلقة بهذا العمل. يتلقى المختبر (SSK) التمويل من Tolero، Humanigen، طائرة ورقية، Lentigen، Morphosys، والأكتينيوم.

في هذا التقرير، نقوم بوصف منهجية لاستخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9 للحث على إدخال تعديلات ثانوية في خلايا CAR-T. وعلى وجه التحديد، يتضح ذلك باستخدام الانكلب الفيروسي مع ناقل فيروسي يحتوي على gRNA يستهدف جين الاهتمام وCas9 لتوليد خلايا GM-CSFk/o CART19. كنا قد أظهرت سابقا أن تحييد GM-CSF يخفف CRS وNT في نموذج xenograft. 12 كما هو موضح سابقا، جنرال موتورز-CSFk /o CAR-T الخلايا تسمح لتثبيط GM-CSF أثناء عملية التصنيع، والحد بشكل فعال من إنتاج GM-CSF مع الحفاظ على وظائف الخلايا T الح...

مستقبلات مستضد Chimeric T (CAR-T) العلاج الخلوي معارض وعد كبير في علاج السرطان. 1 , 2 اثنين من العلاجات الخلية CAR-T التي تستهدف CD19 (CART19) تمت الموافقة عليها مؤخرا في الولايات المتحدة في أوروبا لاستخدامها في الأورام الخبيثة الخلية B بعد إظهار نتائج ملفتة للنظر في التجارب السريرية متعددة المراكز. 3 , 4 , 5 الحواجز التي تحول دون الاستخدام الأكثر انتشاراً لخلايا CAR-T هي نشاط محدود في الأورام الصلبة والسمية المرتبطة بها بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والسمية العصبية (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 لتعزيز المؤشر العلاجي للعلاج بالخلايا CAR-T، يتم استخدام أدوات هندسة الجينوم مثل nucleases إصبع الزنك، TALENs، وCRISPR لمزيد من تعديل خلايا CAR-T في محاولة لتوليد خلايا CAR-T أقل سمية أو أكثر فعالية. 10 سنوات , 11
في هذه المقالة، نقوم بوصف طريقة لتوليد خلايا CAR-T تحرير CRISPR/Cas9. والهدف المحدد من هذه الطريقة هو تعديل وراثيا خلايا CAR-T أثناء تصنيع الخلايا CAR-T عن طريق CRISPR /Cas9 لتوليد خلايا CAR-T أقل سمية أو أكثر فعالية. ويستند الأساس المنطقي لتطوير هذه المنهجية على الدروس المستفادة من التجربة السريرية للعلاج بالخلايا CAR-T، مما يشير إلى الحاجة الملحة لاستراتيجيات جديدة لزيادة النافذة العلاجية للعلاج بالخلايا CAR-T وتوسيع نطاق التطبيق إلى الأورام الأخرى ويدعمها التقدم الأخير في البيولوجيا الاصطناعية مما يسمح تعديلات متعددة من خلايا CAR-T التي بدأت في دخول العيادة. في حين يتم تطوير العديد من أدوات هندسة الجينوم وتطبيقها في بيئات مختلفة، مثل nucleases إصبع الزنك، TALENs، وCRISPR، منهجيتنا تصف تعديل CRISPR /Cas9 من خلايا CAR-T. 10 سنوات , 11 CRISPR/Cas9 هو آلية الدفاع البكتيرية المستندة إلى الحمض النووي الريبي التي تم تصميمها للقضاء على الحمض النووي الأجنبي. يعتمد CRISPR على endonucleases لشق تسلسل مستهدف تم تحديده من خلال دليل RNA (gRNA). يوفر تحرير كريسبر لخلايا CAR-T العديد من المزايا على الأدوات الهندسية الأخرى للجينوم. وتشمل هذه الدقة في تسلسل gRNA، والبساطة لتصميم gRNA استهداف جين الاهتمام، وكفاءة تحرير الجينات العالية، والقدرة على استهداف جينات متعددة حيث يمكن استخدام gRNAs متعددة في نفس الوقت.
على وجه التحديد في الأساليب الموصوفة هنا، استخدمنا عدس ترميز كريسبر دليل RNA وCas9 لتعطيل الجينات أثناء نقل CAR من الخلايا T. في اختيار تقنية مناسبة لتحرير خلايا CAR-T، نقترح التقنية الموصوفة هنا هي آلية فعالة لتوليد خلايا CAR-T الصف البحوث، ولكن لأن تأثير على المدى الطويل من التكامل الدائم من Cas9 في الجينوم غير معروف، ونحن اقتراح هذه المنهجية لتطوير دليل على مفهوم البحوث الصف CAR-T الخلايا ولكن ليس لإنتاج جيد تصنيع الممارسة الصف CAR-T الخلايا.
على وجه الخصوص، هنا نقوم بوصف جيل من الخلايا الحبيبية الضامة مستعمرة تحفيز عامل (GM-CSF) بالضربة القاضية CAR-T الخلايا التي تستهدف CD19 البشرية. تم إنشاء هذه الخلايا CAR-T عن طريق التحويل مع الجسيمات اللينة ترميز الحمض النووي الريبي دليل محدد إلى GM-CSF (اسم الجينات CSF2) وCas9. وجدنا سابقا أن تحييد GM-CSF يخفف CRS وNT في نموذج xenograft. 12 GM-CSFك / س CAR-T الخلايا تسمح لتثبيط GM-CSF خلال عملية التصنيع، والحد بشكل فعال من إنتاج GM-CSF مع تعزيز CAR-T خلية النشاط المضاد للورم والبقاء على قيد الحياة في الجسم الحي مقارنة مع خلايا CAR-T من النوع البري. 12 وهكذا، هنا نحن نقدم منهجية لتوليد كريسبر / Cas9 تحرير خلايا CAR-T.

<table><tbody><tr><td>CD3 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (OKT3) ، PE ، eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 الجسم المضاد أحادي النسيلة (UCHT1) ، APC ، eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (أنظمة العلاج الخلوي) Dynabeads CD3 / CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>بيكمان كولتر</td><td>C10343</td><td>مقياس التدفق الخلوي</td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد</td><td>ميليبور سيجما</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (مكثف الجسيمات المغناطيسية)</td> <td>الأنظمة الحيوية</td><td>التطبيقية A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human T Cell Cell Isolation Kit &nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>الخرز المغناطيسي السلبي ؛ 17951RF يتضمن نصائح وعازلة</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD107a &nbsp ؛</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>وسط التثبيت (متوسط أ)</td> <td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA البناء: الاسم: CSF2 دليل CRISPR RNA 1 ؛ الأنواع: الإنسان ، المتجه: pLentiCRISPR v2 ؛ المقاومة: أمبيسلين. رقم النسخة: عالية ؛ تحضير البلازميد: التسليم القياسي: 4 مو ؛ ز (مجاني من الرسوم)</td> <td>GenScript</td><td>N / A</td><td>طلب مخصص</td></tr><tr><td>الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td>مصل علم <td>الوراثة</td><td></td><td></td>البشري AB سطح المكتب</tr><tr><td>. المتبرعون الذكور؛ اكتب AB الولايات المتحدة</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN جاما الجسم المضاد أحادي النسيلة (4S. B3) ، APC-eFluor 780 ، eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 كاشف التعداء</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ، من أجل إثارة 405 نانومتر</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin Solution ، 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>ماوس مضاد للإنسان CD28 استنساخ CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>ماوس مضاد للإنسان CD49d استنساخ 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>ماوس مضاد للإنسان MIP-1 & beta ؛ PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>السيد Frosty Frozen Container</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6 ، استنساخ G5 & nbsp ؛</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>خط خلايا ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد</td></tr> خالية من <tr><td>النوكليز</td> أنظمة تصفية الفراغ <td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus ، 500 مل ، غشاء PES ، 0.22 ميكرومتر ، معقم</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene وحدات تصفية معقمة سريعة التدفق يمكن التخلص منها مع غشاء CN 0.45uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I مصل مخفض متوسط (1X) ، سائل</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 ماوس مضاد للإنسان IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين (100X) ، السائل</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>وسط نفاذية (متوسط ب)</td> <td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>بوروميسين ثنائي هيدروكلوريد</td><td>MP Biomedicals، Inc.</td><td>0210055210</td><td></td></tr><tr><td>طقم استخراج جل QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>الفئران المضادة للإنسان GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td> فاصل <td>الخلايا الآلي بالكامل</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم ، 5٪ (وزن / حجم)</td> <td>ريكا كيماويكال</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 خلية مكونة للدم خالية من المصل متوسطة</td><td>لونزا</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

استخدام كريسبر / cas9 لضرب جنرال موتورز-csf في خلايا car-t

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

مستقبلات مستضد Chimeric T (CAR-T) العلاج الخلوي هو أحدث ويحتمل أن تكون ثورية خيار العلاج الجديد للسرطان. ومع ذلك، هناك قيود كبيرة على استخدامه على نطاق واسع في علاج السرطان. وتشمل هذه القيود تطوير سمية فريدة من نوعها مثل متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والسمية العصبية (NT) والتوسع المحدود، وظائف التأثير، والنشاط المضاد للورم في الأورام الصلبة. وتتمثل إحدى الاستراتيجيات الرامية إلى تعزيز فعالية CAR-T و/أو السيطرة على سمية خلايا CAR-T في تحرير جينوم خلايا CAR-T نفسها أثناء تصنيع خلايا CAR-T. هنا، ونحن نصف استخدام كريسبر / Cas9 تحرير الجينات في خلايا CAR-T عن طريق transduction مع بنية لينتيفيروسي تحتوي على دليل RNA إلى حبيبات الضامة مستعمرة تحفيز عامل (GM-CSF) وCas9. على سبيل المثال، نحن نصف كريسبر / Cas9 بوساطة بالضربة القاضية من GM-CSF. لقد أظهرنا أن هذه الخلايا GM-CSFك / س CAR-T تنتج بشكل فعال أقل GM-CSF مع الحفاظ على وظيفة الخلية T الحرجة وتؤدي إلى تعزيز النشاط المضاد للورم في الجسم الحي مقارنة مع خلايا CAR-T من النوع البري.

ويبين الشكل 1 انخفاض معدل الـ GM-CSF في خلايا GM-CSFk/o CART19. للتحقق من أن الجينوم من الخلايا T تم تغييره إلى ضربة قاضية GM-CSF، تم استخدام تسلسل TIDE في الخلايا GM-CSFk/o CART19 (الشكل1A). CAR-T بقعة الخلية تلطيخ يتحقق من أن الخلايا T تعبر بنجاح عن مستقبلات سطح CAR في المختبر عن طريق التجصاق على خلايا CD3 + الحية (الشكل1B). تلطيخ داخل الخلايا من GM-CSF عن طريق قياس التدفق الخ...

هنا، نقدم بروتوكولا ً للتحرير الوراثي لخلايا CAR-T عبر نظام CRISPR/Cas9.

استخدام كريسبر / Cas9 لضرب جنرال موتورز-CSF في خلايا CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

يصف بروتوكولنا التعديل الوراثي لخلية CAR-T أثناء تصنيعها عبر تقنية CRISPR لتوليد منتج أكثر فعالية وأقل سمية. ومن مزايا هذه التقنية أن إنتاج الخلايا CAR-T والتلاعب الجيني يمكن أن يحدثا في خلية واحدة بكفاءة جيدة. وسوف يكون إثبات الإجراء روزالي ستيرنر، طالبة دكتوراه في الطب، وميشيل كوكس، أخصائية تقنية وطالبة دراسات عليا، وروونا ساكيمورا، زميلة ما بعد الدكتوراه، من مختبري.بعد عزل الخلايا التائية من خلايا الدم الطرفية أحادية النوى، ابدأ في زراعةها عن طريق إعداد خلية T أولاً المتوسطة ثم تعقيمها عن طريق تصفيتها من خلال فلتر فراغ معقم 0.45 ميكرومتر ثم مع فلتر فراغ معقم 0.22 ميكرومتر. في يوم من التحفيز T-الخلية أو يوم صفر, قبل التحفيز, غسل CD3/CD28 الخرز عن طريق وضع حجم المطلوب من الخرز في أنبوب microcentoruge 1.5 milliliter معقمة و resuspending في ملليلتر واحد من TCM. ضع الأنبوب على اتصال مع المغناطيس لمدة دقيقة واحدة.ثم تطن TCM و resuspend في ملليلتر واحد من TCM الطازجة لغسل الخرز مرة أخرى وتكرار ما مجموعه ثلاثة يغسل. وأخيرا، resuspend الخرز في ملليلتر واحد من TCM. بعد عد الخلايا التائية، نقل الخرز إلى الخلايا التائية بنسبة ثلاثة إلى حبات واحدة إلى خلايا.ثم تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من مليون خلية لكل ملليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد الحصول على بناء CART19 في متجه من العدس ، قم بأداء إنتاج العدسي فيفيرال عن طريق حضن أول بلازمات ، متجه التعبئة ، متجه المغلف ، مُعَد مُعَد ، مُشفر مُنْتَرَب ، ووسيلة نقل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. القيام بأعمال العدس باستخدام الاحتياطات BSL2 + بما في ذلك أغطية الخلية ثقافة، ومعدات الحماية الشخصية، وتطهير المواد المستخدمة مع التبييض قبل التخلص منها.بعد الاحتضان، إضافة هذه الكواشف transfection إلى 293 T-الخلايا التي وصلت إلى 70 إلى 90٪ التقاء وتربية الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في 24 و 48 ساعة بعد transfection، والحصاد، والطرد المركزي، وتصفية ومركزة التي تحتوي على الفيروس فوق النفي وتجميد في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. في اليوم الأول، إعادة التركيز بلطف الخلايا التائية التي تم تحفيزها في مليون خلية لكل ملليلتر في اليوم صفر من أجل تفريق الورديات من الخلايا.في إطار الاحتياطات BSL2 + المناسبة، إضافة فيروس حصاد الطازجة أو المجمدة إلى الخلايا التائية محاكاة في تعدد العدوى من 3.0. مواصلة احتضان الخلايا التائية المستحثة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في الأيام الثالثة والخامسة، عد خلايا CAR-T وإضافة TCM جديدة قبل الدفء إلى الثقافة للحفاظ على تركيز خلية CAR-T من مليون خلية لكل ملليلتر.بعد ستة أيام من المحاكاة، وإزالة الخرز من الخلايا التائية المُعادة عن طريق الحصاد أولاً وإعادة تعليق الخلايا. نقل الخلايا في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر ووضع الأنابيب في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. بعد جمع الخلايا التي تحتوي على CAR-T supernatant والتخلص من الخرز، وضع الخلايا مرة أخرى في الثقافة بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر في قارورة الثقافة.استخدم عينة من الخلايا لجرية تدفق الخلايا لتقييم التعبير السطحي للـ CARs. احتضان البقية لاستئناف التوسع ثم حصاد وحفاظ الخلايا في اليوم الثامن كما هو موضح في المخطوطة. لتعطيل عامل تحفيز مستعمرة الضامة الحبيبية، استخدم دليل RNA كما هو موضح في المخطوطة.يحضن الكواشف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، إضافتها إلى 293 T-الخلايا التي وصلت إلى 70 إلى 90٪ التقاء وتربية الخلايا المُصابة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لإنتاج فيروس العدس. في 24 و 48 ساعة، والحصاد والتركيز التي تحتوي على الفيروس supernatant عن طريق الطرد الشديد في 50 ملليلتر أنابيب فائقة الحرارة وتجميد في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.ثم في اليوم الأول، إعادة تعليق بلطف الخلايا التائية لتفريق الورود. في مختبر معتمد من BSL2+، لتوليد خلايا CAR-T، أضف فيروس العدس CAR19 وفيروس النسل الثلاثي الريكسر الذي يستهدف الخلايا التائية. في اليوم الثالث واليوم الخامس ل الخلايا التائية التي تم تحريرها من قبل LentiCRISPR بنجاح، وهي تحمل مقاومة البورومايسين، تعالج الخلايا التي تحتوي على البوروميسين ديهيدروكورايد بتركيز ميكروغرام واحد من البورومايسين لكل ملليلتر.تم استخدام تسلسل المد لتأكيد تخفيض GM-CSF في خلايا GM-CSF خروج المغلوب CART19 مع كفاءة تعطيل ما يقرب من 71٪ تدفق المؤامرات من سطح الخلية CAR-T تلطيخ على الخلايا الإيجابية CD3 حية تبين أن كلا من البرية من نوع CART19 وجنرال موتورز-CSF خروج المغلوب CART19 بنجاح وبطريقة مماثلة التعبير عن مستقبلات سطح CAR في المختبر. من ناحية أخرى، تلطيخ داخل الخلايا من GM-CSF بواسطة تدفق cytometry بوابات أيضا على الخلايا الإيجابية CD3 حية يوضح انخفاض التعبير عن GM-CSF في خلايا خروج المغلوب مقارنة مع خلايا CART19 البرية من النوع مما يؤكد النجاح الوظيفي لل بالضربة القاضية. وينبغي توخي الحذر بشكل خاص أثناء خطوات النقل لهذا الإجراء لأنها الأكثر أهمية لتطوير خلايا CAR-T المعدلة وراثيا.ويمكن تطبيق المنهجية المذكورة على مجموعة متنوعة من الجينات لتعديل خلايا CAR-T عبر CRISPR/CAS9 للمساعدة في توليد منتج أقل سمية وأكثر فعالية. توفر تكنولوجيا CRISPR/CAS9 استراتيجيات لاستهداف جينوم خلايا CAR-T مباشرة لهندسة الحلول لأوجه القصور السريرية الحالية.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

يحدد الفيديو عملية إنشاء خلايا CAR T المعدلة وراثيا من خلال نظام CRISPR-Cas9. يؤدي إصابة الخلايا التائية بفيروسات العدسات CRISPR و CAR إلى تعديلات على الجين المستهدف وتخليق مستقبلات مستضد خيميرية أو CAR ، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين خلايا CAR T المعدلة وراثيا.

التعديل الوراثي للخلايا التائية CAR باستخدام نظام CRISPR-Cas9

يوضح هذا الفيديو اختبارا لإجراء تحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. يتم دمج مزيج من الخلايا التائية الأولية CD4 + و CD8 + مع مركب البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 ، الذي يستهدف جينات معينة بالضربة القاضية. عند التثقيب الكهربائي ، يوجه sgRNA Cas9 إلى تسلسل الحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى إجراء تخفيضات دقيقة. ثم يتم إصلاح هذه الجروح بواسطة آلية الانضمام الطرفية غير المتجانسة للخلية ، مما يؤدي إلى خروج المغلوب الجيني.

تقنية CRISPR-Cas9 لتحرير الجينات في الخلايا التائية

تحرير الجينات المستهدفة باستخدام كريسبر/Cas9 وسهلت إلى حد كبير فهم الوظائف البيولوجية للجينات. هنا، فنحن نستخدم المنهجية كريسبر/Cas9 إلى نموذج calreticulin الطفرات في الخلايا المكونة للدم تعتمد على سيتوكين بغية دراسة نشاطها النمطان.

كريسبر/Cas9 باستخدام الجينات للتحقيق في نشاط النمطان Calreticulin المسخ في الخلايا المكونة للدم سيتوكين تعتمد على تحرير

بروتوكول لسريع كريسبر/Cas9-بوساطة تعطيل الجينات في الماوس والخلايا المكونة للدم الابتدائي البشرية الموصوفة في هذا المقال. وقدم ريبونوكليوبروتينس Cas9-سجرنا عبر انهانسر مع سجرناس التي تم إنشاؤها عن طريق النسخ في المختبر و Cas9 التجارية. وتتحقق الكفاءة العالية التحرير مع ضيق الوقت والتكلفة المالية.

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

كثيرا ما كانت التقليدية دراسات فقدان لوظيفة الجينات باستخدام الحيوانات خروج المغلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. على أساس انهانسر كريسبر بوساطة الطفرات الجسدية أداة قوية لفهم وظائف الجينات في الجسم الحي. هنا، نحن التقرير طريقة لتحليل تعمل خروج المغلوب في تكاثر خلايا المخيخ.

فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات

هنا، نقدم بروتوكولا لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR Cas لتعديل خلايا CAR-T.

إنتاج خلايا CAR-T البشرية التي تم تصميمها من قبل CRISPR

تعد الاستراتيجيات الجديدة لنمذجة الطفرات الجسدية بأمانة في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs) ضرورية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم والأورام الخبيثة الدموية بشكل أفضل. هنا ، يتم وصف بروتوكول لنمذجة طفرات كسب الوظيفة غير المتجانسة في HSPCs من خلال الجمع بين استخدام CRISPR / Cas9 ونقل المانحين rAAV المزدوج.

هندسة طفرات اكتساب الوظيفة غير المتجانسة المنشأ في الخلايا الجذعية البشرية المكونة للدم والخلايا السلفية

هنا ، نصف طريقة لتغيير التعبيرات الجينية بشكل انتقائي في الضفيرة المشيمية مع تجنب أي تأثير في مناطق الدماغ الأخرى.

ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية

تصف المقالة بروتوكولا لتطبيق نموذج في المختبر للإرهاق لإكمال شاشة خروج المغلوب CRISPR على مستوى الجينوم في الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري السليمة من المتبرع السليم.

إجراء شاشة CRISPR بالضربة القاضية على مستوى الجينوم في المختبر في الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري

طورنا بروتوكول فحص CRISPR-Cas9 المحسن لخلايا CAR T الأساسية. من خلال تقليل انتقال gDNA عبر الهضم الإنزيمي وسحب كاسيت sgRNA، يقلل هذا النهج من تشوهات PCR، مما يضمن الكشف الدقيق عن sgRNA والتعرف القوي على الأهداف الجينية الوظيفية.

تحسين شاشات CRISPR-Cas9 في خلايا CAR T الآن: طريقة محسنة للتحضير في المكتبات

تعلم تعديل خلايا CAR-T وراثياً باستخدام تقنية CRISPR/Cas9 أثناء التصنيع لإنتاج علاج أكثر فعالية وأقل سمية. يتيح هذا البروتوكول دمج الإنتاج والتعديل الجيني في خطوة واحدة.

استخدام كريسبر / Cas9 لضرب جنرال موتورز-CSF في خلايا CAR-T

استكشف المزيد من الفيديوهات