استكشاف مساحة التسلسل لتحديد مواقع الربط للبروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي التنظيمية

ويستخدم البروتوكول لتشبع الطفرات من موقع البروتين ملزمة. إذا لم يكن موقع الربط البروتيني الخاص بك معروفًا، يمكن تحديده باستخدام هذا البروتوكول. هذه التقنية لها صلة لتشخيص المرض والعلاج.

وأعتقد أن إمكاناتها الكاملة في العلوم الطبية الحيوية لا تزال يتعين استغلالها بالكامل. يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع على أي بروتين أو رد فعل حيث يمكن فصل الجزيئات المطلوبة من الجزيئات غير المرغوب فيها. تأكد من أن المكتبة هي عشوائية بشكل صحيح، وتأكد من أنه خلال كل خطوة ربط وفصل أضعاف إثراء الجزيئات المطلوبة عالية.

وهو ينطوي على عدة خطوات وتفاصيل كثيرة يتم توضيحها بشكل أفضل ، بدلاً من شرحها بالكلمات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون مرتاحًا لكيفية إعداد مكتبة عشوائية ، وتجميع تجمع RNA ، وإجراء تفاعل ملزم للجزيئات المنفصلة المرغوبة وغير المرغوب فيها للحصول على تقارب عالي وموثقات محددة. أولا، توليف التمهيدي إلى الأمام وا لأولية عكسها عن طريق التركيب الكيميائي على المزج الحمض النووي.

أيضا، توليف قالب oligonucleotide مكتبة عشوائية مع 31 المواقف العشوائية. في أنبوب PCR، مزيج واحد micromolar الحمض النووي قالب مكتبة عشوائية، واحد micromolar إلى الأمام التمهيدي يحتوي على T7 RNA البوليميراز المروج واكتبي عكس، 20 ملليمولار تريس في رقم هيدروليكي ثمانية، 1.5 ملليمولار كلوريد المغنيسيوم، 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ميكروغرام لكل ملليلتر أسيتتيلات مصل الأسيتين الألبومين، وحدتين من البوليميراز طق، و 200 ميكرومولر كل من dNTPs. إعداد جهاز PCR مع خمس دورات من denaturation، والحن، وخطوات التمديد، تليها دورة واحدة من التمديد لإرفاق المروج إلى مكتبة الحمض النووي.

إعداد رد فعل النسخ 100 ميكرولتر تحتوي على T7 النسخ العازلة، واحد micromolar بركة مكتبة عشوائية الحمض النووي، خمسة ملليمولار DTT، 2 ملليمتر GTP، ملليمتر واحد كل من ATP، CTP، وUTP، واثنين من وحدات لكل ميكرولتر T7 RNA البوليميراز. الآن وضعت على درع زجاجي الاكريليك والقفازات. إدخال النشاط الإشعاعي عن طريق إضافة 5 ميكرولترات أو أقل من ألفا-32P UTP في رد فعل النسخ للتصوير الذاتي.

احتضان خليط التفاعل في أنبوب microcentrifuge لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. لجل تنقية الجيش الملكي النيبالي، وإعداد هلام بولياكريلاميد 10٪denaturing. تحميل العينات في آبار الجل.

عرض الجل للفيلم بالأشعة السينية، وتحديد موقع النصوص على هلام وقطع شريحة هلام. ضع شريحة الجل في أنبوب الطرد المركزي واقطع إلى قطع أصغر مع طرف التجانس. إضافة البروتين K العازلة لتزج القطع هلام.

اترك الأنبوب على المُطعم لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم تدور في الطرد المجهري عالية السرعة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحطام هلام واستعادة الحل العازلة. أضف كمية متساوية من الفينول-كلوروفورم إلى الأنبوب مع المُتَرَض، الدوامة، والطرد المركزي.

كرر استخراج مع الفينول-كلوروفورم مرة أخرى ثم مع كلوروفورم مرة أخرى. بعد ذلك، اخلطي المرحلة مائي من البروتينات K العازلة مع 1/10 حجم من خلات الصوديوم ثلاثة المولار في درجة حرارة 5.2، 10 ميكروغرام من الرنا أو 20 ميكروغرام من الجليكوجين، واثنين إلى ثلاثة مجلدات من الايثانول المخزنة في ناقص 20 درجة مئوية. اترك الأنبوب عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لساعة واحدة.

تدور أنبوب يحتوي على الحل لمدة خمس إلى 10 دقائق في أربع درجات مئوية في microcentrifuge. تجاهل supernatant بعناية، وإضافة 70٪ الإيثانول لشطف بيليه الجيش الملكي النيبالي. تدور لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.

التعرق الإيثانول بعناية، والهواء الجافة بيليه الحمض النووي الريبي. المقبل، إضافة 50 ميكرولترات من المياه المعالجة مع DEPC ل solubilize بيليه الجيش الملكي النيبالي. اترك العينة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية للتخزين.

لربط البروتين والRNA في حجم رد فعل من 100 ميكرولترات، أولا إعداد 10 ملليمولار تريس هيدروكلوريد في 7.5 pH تحتوي على 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم، واحد ملليمولار DTT، 09 ميكروغرام لكل ميكرولتر بولين مصل البقر، 5 وحدات لكل ميكرولتر RNAsin، 15 ميكروغرام لكل ميكرولتر TRNA، و1 ملليمورار EDTA. ثم إضافة 30 ميكرولترات من البروتين المؤتلف PTB و 10 ميكرولترات من RNA من التجمع المناسب. ضع الأنابيب التي تحتوي على التفاعلات الملزمة في كتلة درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.

المقبل، تجزئة الجيش الملكي النيبالي من الجيش الملكي النيبالي غير المنضم من خلال أربع جولات من الاختيار والتضخيم. أولاً، قم بتصفية عينة 100 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة من خلال فلتر نيتروسيلولوزي متصل بفراغ متعدد. يبقى مجمع البروتين الـ RNA على الفلتر.

مع شفرة حلاقة معقمة، قم بقطع الفلتر إلى شظايا، وأدخل هذه في أنبوب الطرد المركزي. غمر قطع التصفية في مخزن البروتينات K المؤقت، وضعه على بهلوان لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها لاسترداد الحمض النووي الريبي. لفك البروتين العينة RNA، إضافة حجم متساو من الفينول الكلوروفورم، دوامة، ثم الطرد المركزي بسرعة عالية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

الحصول على المرحلة مائي، واستخراج مع الكلوروفورم مرة أخرى. بعد ذلك، اخلطي الماجنة مع حجم 1/10 من خلات الصوديوم ثلاثية المولر عند الأسكH 5.2 واثنين إلى ثلاثة مجلدات من الإيثانول المطلق. اترك الأنبوب في ثلاجه مئوية ناقص 80 درجة لمدة 30 دقيقة، ثم طرد مركزي بسرعة عالية لمدة 10 دقائق.

كرر خطوات الغسيل والتجفيف مع 70٪ من الإيثانول، و solubilize الجيش الملكي النيبالي في المياه المعالجة DEPC. بعد الجولة الأولى من تصفية ربط الفحص، تنفيذ ثلاث جولات أخرى. بعد ذلك، قم بتنفيذ جولتين من النسخ، والربط، والتضخيم لفصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين عن الكسور غير المنضمة.

Precast الأصلي 5 ٪ polyacrylamide هلام مع 60 إلى واحد الاكريلاميد - bis - الاكريلاميد نسبة في 5x TBE العازلة. ثم إعداد رد فعل ملزم RNA البروتين. وضع الجل في جهاز الكهرباء مملوءة العازلة TBE 5x في غرفة باردة في أربع درجات مئوية.

تطبيق 250 فولت لمدة 15 دقيقة، والميصة رد فعل ملزم في آبار مختلفة. ثم تجزئة إضافية من RNA المنضمة من RNA غير منضم عن طريق تشغيل الكهرباء في 250 فولت لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك، قم بكشف الجل للفيلم بالأشعة السينية، وتحديد موقع الحمض النووي الريبي المقيد باستخدام التصوير الآلي.

قطع شريحة هلام مع الجيش الملكي النيبالي منضم، وإدراجه في أنبوب. سحق شريحة هلام، واحتضان في المخزن المؤقت البروتينات K لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها. كرر الاستخراج بالفينول- الكلوروفورم والكلوروفورم كما سبق وصفه.

توليف cDNA من الحمض النووي الريبي المذاب. إعداد 20 ميكرولترات من رد الفعل، بما في ذلك اثنين من microliters من 10x RT العازلة، واثنين من microliters من النسخ العكسي AMV، وميكر واحد من التمهيدي العكسي، وخمسة ميكرولترات من الماء، و 10 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المذاب. احتضان في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

تضخيم cDNA باستخدام 20 إلى 25 دورة PCR كما هو موضح سابقا. كرر عملية تخليق الحمض النووي الريبي، البروتين ملزمة، وفصل البروتين ملزمة وغير منضم الكسور. لتحليل ربط البروتين، استخدم تحليل تحول الهلام أو مقايسة الربط للتصفية لتحديد تقارب الربط وخصوصية تجمعات محددة أو تسلسلات فردية داخل كل تجمع.

استخدام التصوير الآلي أو صورة الفوسفور للكشف عن وقياس النطاقات في الكسر المنضم والكسر غير المنضم. متابعة البروتوكول مع استنساخ ومحاذاة التسلسل. وفي هذه الدراسة، تم تحقيق نجاح في عملية التضخيم في الاختيار.

يظهر البروتين الملزم للثدييات متعدد المسالك البوليبيريمين مع تركيز البروتين العالي 300 ضعف الربط بالكاد يمكن اكتشافه لتسلسل التجمع صفر ولكن تقاربًا عاليًا لتجمع التسلسل المحدد. اختيار التضخيم التي تم تحديدها بنجاح على البروتينات RNA ملزمة مع موقع الربط المفضل أو توافق الآراء. إضافة PTB المؤتلف، الذي يربط إلى موقع ربط ثلاثة رئيس المنبع، يؤدي إلى تنشيط موقع لصق ثلاثة رئيس بديل أو المصب.

في المقابل، إضافة المؤتلف hnRNP C يؤدي إلى قمع كل من ثلاثة رئيس لصق المواقع. بالإضافة إلى عامل الربط العام المؤتلف U2AF65 عكس hnRNP C-بوساطة ثلاثة رئيس موقع لصق القمع. من المهم أن نتذكر أن مكتبة جيدة عشوائية وشروط ملزمة السليمة التي تعطي إثراء أضعاف عالية في كل خطوة ملزمة ضرورية للنجاح.

يمكن استخدام الفحوصات الوظيفية المناسبة والاختبارات الحية للتحقق من صحة نتيجة هذا النهج. في مجال التعبير الجيني، تمت دراسة وظائف العديد من البروتينات باستخدام هذه التقنية. من المهم استخدام القفازات والختم المشع للحماية أثناء العمل مع البولي أكريلاميد والنشاط الإشعاعي.