التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

يوفر الارنا الكهربائي التعبير السريع والفعال، والسيطرة المكانية والزمانية من البروتينات المتعددة داخل نظام نموذج الطيور. هذه الطريقة تسمح للتعبير عن بروتينات الفلورسنت بشكل أوسع وأسرع من وضع العلامات التي يحققها الكهربة القياسية للحمض النووي. Electroporation يسهل فتح عابرة من المسام في غشاء البلازما التي تعمل كقنوات لنقل الحمولات الوراثية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي في خلايا العديد من الكائنات الحية النموذجية.

للتجارب الأولية العمل مع الأجنة التي هي أقدم من يوم واحد من العمر لأنها أكثر صلابة وأكثر مقاومة للتلاعب الخارجي مثل الكهربائي. في مرحلة النمو الجنيني المناسبة كسر بلطف وتصب محتويات بيضة السمان في طبق بيتري 10 سم. استخدام ماصة نقل لإزالة غالبية الألبومين سميكة.

استخدم نسيج المختبر لمسح سطح النير برفق لإزالة الألبومين السميك المتبقي حول الجنين لضمان أن الجنين سيلتصق بإحكام بحلقة الورق. وضع ما قبل قص ورقة التصفية على الجنين واستخدام مقص لقطع بسلاسة حول محيط الجنين. استخدام ماصة باستور لطبقة PPS تحت الجنين باستخدام تيارات لطيف لإخلاء أي نير التمسك الأنسجة.

سحب ببطء حلقة ورقة الجنين في زاوية مائلة صعودا و الخروج من نير. ضع الورق في طبق بيتري مليء بـ PBS لمزيد من التنظيف. بمجرد إزالة معظم النير ، ضع الجانب البطني للجنين في طبق بيتري من 35 ملليمتر مغطى بمزيج نصف أولي من أجار وألبومين.

إعداد غرفة الكهربائي عن طريق ربط القطب الأسود ملء مع برنامج تلفزيوني ووضع الجنين في الداخل. استخدام الزجاج microcapillary لحقن bolus من 200 نانويترات من مرنا في تجويف بين epiblast والغشاء vitelline تغطي المنطقة المطلوبة. ثم استخدم القطب الأحمر لكهرباء الجنين.

ضع الجنين الكهربائي مرة أخرى على خليط agar-albumen وحضن في درجة حرارة 38 درجة مئوية حتى مرحلة النمو المرغوب فيها. لتصوير البروتينات الفلورية المشفرة بالكهربية مراقبة جميع الأجنة الكهربائية تحت منظار تشريح الفلورسنت لتحديد أصح وأفضل الجنين الكهربائي لتجارب التصوير الديناميكية. الاستمرار في احتضان الأجنة الأخرى مطلية بالكهرباء والأجنة غير الكهربائية في حاضنة منفصلة.

شطف لفترة وجيزة الجنين المختار مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي فقاعات التي قد تكونت على الجانب الظهري من الجنين أثناء الكهربة. ضع الجنين الذي تم تنظيفه مباشرة في طبق تصوير يحتوي على طبقة رقيقة من حوالي 150 ميكرولتر من الألبومين-أجار مع الحرص على عدم توليد أي فقاعات على السطح الظهري للجنين. أضف قطعة صغيرة رطبة ملفوفة من ورق الأنسجة على طول الحواف الداخلية لطبق التصوير.

ختم الطبق مع فيلم البارافين للحد من التبخر أثناء التصوير والاحتضان. نقل الطبق بسرعة إلى مرحلة ما قبل الدفء من المجهر confocal واستخدام قناة brightfield لتحديد موقع الصبغة الملونة في الجنين. تعيين برنامج التصوير إلى الهدف المنشود، مرآة dichroic، وأطياف الانبعاثات، وتشغيل الليزر المناسبة.

الحرص على أن الخلايا سوف تبقى في رؤية الصورة لكامل الفيلم. استخدم دقة تصوير عالية بما فيه الكفاية، وتأكد من أن ظروف التصوير لن تسبب السمية الضوئية. انقر على Live في برنامج التصوير وضبط طاقة الليزر إلى إعداد مناسب لكثافة الفلوريسكين اعتماداً على كل قوة ليزر مجهرية.

ابدأ تصوير الجنين باستخدام قوة ليزر 1٪، ومكسب 800، مما يزيد من قوة الليزر ببطء بزيادات 1٪، حتى يتم رؤية وحدات البكسل المشبعة. عندما يتم ملاحظة وحدات البكسل المشبعة، تقل طاقة الليزر قليلاً حتى لا يمكن تصور أي بيكسلات مشبعة. صورة الجنين كل ثلاث إلى خمس دقائق للتحقق من هجرة الخلايا الفردية عبر نقاط زمنية مختلفة باستخدام خمس ميكرومتر Z-اكوام من المنطقة الكهربائية بأكملها مع بعض الغرفة الإضافية نحو الجزء السفلي من Z المكدس في حالة غرق الجنين في سرير agarose خلال جلسة التصوير.

لمراقبة مدى سرعة الخلايا تتحرك تحقق من النقاط الزمنية القليلة الأولى من الفيلم الأول. إذا كانت الخلايا تتحرك بمعدل سريع، ففكر في توسيع التكبير/التصغير لمنطقة الصور أو تصوير منطقة مختلفة. عندما تم تصوير المنطقة الكاملة من الطلاء الكهربائي للجنين، صورة في منطقة غير مُنصفة لنفس الجنين لتحديد مستويات الفلورس التلقائي.

لتحديد المدة التي يمكن أن ينتَوَّر فيها مرنا المُصاب بالعدوى إلى بروتينات فلورية بعد التأكد من الإكتِرْك للجينة ذات الأهمية على المجهر الاستريوي، ضع الجنين على مرحلة محمّدة مسبقًا من المجهر المقلوب واستخدم الليزر 405 نانومتر مع قوة ليزر 70٪ ، و100 تكرار ، وسرعة مسح من أربعة لphotobleach معظم الفلورسينسي الخلوي من الجين الكهربائي في مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية. الاستمرار في احتضان الأجنة على المسرح عند 36 درجة مئوية بعد تبييض الصور ، مع الحرص على الانتباه إلى الخلايا المنقسمة بنشاط داخل المنطقة ذات الضوئية التي عادة ما ينظر إليها فقط في الأجنة السليمة وبالتالي تشير إلى أن الكهرباء لم تضر الخلايا الجنينية. الحصول على ما بعد التبييض Z المكدس الصور من المنطقة الكهربائية لمدة زمنية المطلوب في فترات زمنية منتظمة من ثلاث إلى خمس دقائق.

لضمان أن ظروف التصوير لا تؤثر بشكل ضار على بقاء الجنين في وقت واحد في حضن الأجنة ذات الطلاء الكهربائي غير المُحَمَّن ضوئيًا لتكون بمثابة عنصر تحكم في التصوير. لكميات نتائج photobleaching لخرض مرنا بعد electroporation استخدام ImageJ لقياس كثافة الفلوريسنس من دائرة 7.5 ميكرومتر في وسط المنطقة الكهربائية من كل خلية لتتبع الفلورية الخلية على مدى كل فترة زمنية من ثلاث إلى خمس دقائق. عندما تم قياس جميع الخلايا داخل المنطقة ذات البقعة الضوئية التي لا تخضع للتصلب الضوئي وتم تحسسها بالكامل ، قم برسم شدة الفلوريس مع مرور الوقت بعد التبييض في كل نقطة من النقاط الزمنية التي تم فيها تصوير الجنين ضوئيًا.

على الرغم من أن ال DNA electroporation يؤدي إلى فلورا أكثر إشراقا في بعض الخلايا الكهربائية، وكفاءة كهربائي الحمض النووي هو أقل بشكل واضح بالمقارنة مع البروتينات الفلورية المشفرة مرنا أعرب على نطاق واسع. عند مقارنة الحمض النووي والميرنا المشترك الكهربائي داخل نفس الجنين، فإن الحمض النووي الذي يعبر عن كفاءة البروتين الفلورسنت هو أيضاً أقل كفاءة بشكل كبير وثابت من الحمض النووي الريبي (MRNA) الذي يعبر عن البروتين الفلوري. ويكشف القياس الكمي لجميع الأجنة التي يتم رسمها بـ MRNA أو الحمض النووي أو مزيج من الاثنين، أن مرنا عبر حوالي 75٪ من الخلايا في منطقة معينة، في حين أن الحمض النووي لا يُحول سوى حوالي 25٪ من الخلايا.

وينبغي أن يؤدي الرنا عبر المصابين إلى إنتاج أسرع للبروتين مقارنة بالحمض النووي المتحول لأن الرنا يمكن التعرف عليه على الفور من قبل آلات الترجمة الخلوية. على الرغم من أن الإكتـارة المشتركـة للعديد من DNAs قد ثبت سابقًا أنها غير فعالة نسبيًا ، فقد أدى الإكتـر المـُـرَكَمـيـّة لأربعة من الـ mRNAs في هذه التجربة إلى كفاءة نقل 87٪ لجميع الـ mRNAs الأربعة في جميع المناطق ذات الطلاء الكهربائي. على الرغم من أن photobleaching يقلل في البداية من شدة الفلوريس في الخلايا المضاءة من قبل حوالي 95٪ تبقى بعض الخلايا التي تسترد قدرتها على تقسيم والتعبير عن البروتينات الفلورية بعد وقت قصير من الكهربائي.

هذا قدرة ينخفض على خمسة ساعات بعد electroporation مهما. خذ وقتك في تحسين أفضل ظروف التصوير والاستمرار في العبث حتى بعد بدء الفيلم يجري على استعداد لإجراء أي تعديلات إذا لزم الأمر.