مقايسة معياريه وقابله للتطوير لدراسة الخلايا الغشائية ثلاثية الابعاد المشتقة من iPSC في المختبر

يوضح هذا الفحص في المختبر أن براعم الأوعية في منصة عالية الإنتاجية وقابلة للتطوير. ويمكن استخدام هذا للعثور على أهداف جديدة في تولد الأوعية. يجمع فحص الأوعية بين البيئات الصغيرة الخلوية المعقدة التي تتضمن التدرجات والضخ مع منصة متوافقة مع فحص الإنتاجية العالية.

Angiogenesis يلعب دورا هاما في كل من الصحة والمرض. يمكن أن يساعدنا فهم الآليات التي تحدث أثناء تولد الأوعية الدموية على فهم كيفية نمو السرطانات وكيفية إصلاح الأنسجة. هذه الطريقة يمكن أن تعطي نظرة ثاقبة في الآليات خلال أمراض القلب والأوعية الدموية وتجديد الأنسجة.

في كل من, تولد الأوعية يلعب دورا هاما. لاستخدام لأول مرة من هذه المنصة microfluidic، تحتاج إلى أن تكون على بينة من قانون وحدات التخزين وكيفية ماصة. يمكنك تأكيد الخطوات من خلال النظر تحت المجهر أو التقليب لوحة رأسا على عقب.

بعض الخطوات من الصعب أن يشعر عند مجرد قراءة الأسلوب، على سبيل المثال كيف قنوات microfluidic صغيرة أو كيفية عقد لوحة. إثبات هذه الإجراءات ستكون ويندي ستام، فني من مختبرنا. للبدء، نقل لوحة 384-well microfludic إلى غطاء تدفق لارينار العقيمة.

إزالة الغطاء وإضافة 50 ميكرولترات من المياه أو الفوسفات المخزنة المالحة إلى كل من 40 آبار المراقبة باستخدام ماصة متعددة القنوات. ثم إضافة 1.5 ميكرولترات من أربعة ملليغرام لكل ملليلتر الكولاجين حل واحد إلى مدخل هلام من كل وحدة microfluidic. تأكد من وضع قطرات من هلام في منتصف كل بئر من أجل هلام لدخول القناة.

بعد ملء خمس وحدات microfluidic، الوجه لوحة رأسا على عقب لفحص بصريا الصحيح ملء قنوات هلام. ضع لوحة microfludic في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقائق لبلمرة الكولاجين واحد. ثم تأخذ لوحة للخروج من الحاضنة ونقلها إلى غطاء محرك تدفق معقم.

إضافة 50 ميكرولترات من 10 ميكروغرام لكل ميليلتر فينيمينيكتين حل الترميز إلى منفذ جيدا من قناة القذف العلوي من كل وحدة microfluidic. اضغط على طرف ماصة ضد جانب البئر لتعبئة الصحيح من البئر دون محاصرة فقاعات الهواء. تملأ القناة والمقالي السائلة على المنفذ دون ملء المنفذ بشكل جيد.

ثم ضع اللوحة في الحاضنة لمدة يومين على الأقل. الآن، ذوبان بسرعة في IPSC-ECs المجمدة لمدة تقل عن دقيقة واحدة في حمام الماء 37 درجة مئوية. ثم نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر وإضافة ببطء 10 ملليلتر من المتوسطة القاعدية لتخفيف.

رسم 10 ميكرولترات من الحل وعد الخلايا على عداد الخلية. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 100 مرة ز لمدة خمس دقائق. التعرق دون إزعاج بيليه الخلية و resuspend في الوسط القاعدي لتسفر عن تركيز مرتين 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.

بعد ذلك، نقل لوحة 384-well microfluidic من الحاضنة إلى غطاء تدفق لامين معقمة. استلهم محلول ترميز الليفي من مخرج التسريب وأضف 25 ميكرولترات من الوسيط القاعدي في آبار المنفذ. إضافة قطرة صغيرة واحدة من تعليق الخلية إلى كل مدخل ضخ أعلى جيدا.

تسطيح القطرة في بضع ثوان. تحقق تحت المجهر ما إذا كان البذر متجانسًا داخل قناة واحدة وبين القنوات. احتضان لوحة جيدا microfluidic لمدة ساعة إلى 1.5 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك، تحقق من الخلايا للتأكد من أنها قد انضمت. إزالة المتوسطة القاعدية من أعلى الآبار منفذ الضخ. إضافة ثقافة السفينة الدافئة المتوسطة في مدخل الضخ العلوي والمنفذ.

ضع اللوحة على منصة الروك التي يتم تعيينها على زاوية سبع درجات وثماني دقائق هزاز الفاصل الزمني في الحاضنة. في اليوم الأول واثنين من مرحلة ما بعد البذر، صورة لوحة باستخدام مجهر برايتفيلد مع مرحلة الآلي لتأكيد صلاحية الخلية. بعد يومين، شكلت أحادية التقاء ضد الكولاجين سقالة واحدة.

أولاً، إعداد 4.5 ملليلتر من الأسهم نبتة أوعية من خلال تكملة 4.5 ملليلتر من المتوسطة القاعدية مع 4.5 ميكرولترات من مخزون VEGF، 4.5 ميكرولترات من مخزون PMA، و 2.25 ميكرولترات من مخزون S1P. إعداد 8.5 ملليلتر من متوسط نمو السفينة من خلال استكمال المتوسطة القاعدية مع 5.1 ميكرولترات من VEGF و 3.4 ميكرولترات من BFGF. متوسطة من الآبار وإضافة 50 ميكرولترات من ثقافة السفينة الطازجة المتوسطة في مدخل الضخ العلوي وآبار منفذ ومدخل هلام وآبار منفذ.

ثم إضافة 50 ميكرولترات من خليط براعم أنجيوجينيك إلى كل من مدخل قناة الضخ السفلي وآبار منفذ. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة على منصة الروك من أجل تشكيل تدرج عوامل النمو الوعائية. بعد يوم ويومين من إضافة عوامل النمو الوعائية، استخدم مجهر برايتفيلد لتصوير الآبار على خشبة مسرح آلي.

لدراسة مرض الاستئصال وتثبيت براعم، إضافة ميكرولتر واحد من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر الفلورسنت المسمى الألبومين إلى مدخل الضخ أعلى. ثم اخلطي الحل مع ماصة 50 ميكروليت. نقل لوحة إلى المجهر الفلورسنت مع مرحلة الآلي وحاضنة تعيين في 37 درجة مئوية.

تعيين المجهر في الهدف 10X وتصحيح إعدادات التعرض. احصل على صور فترة زمنية كل دقيقة لمدة 10 دقائق. إزالة لوحة من المجهر ونقل لوحة إلى غطاء تدفق لاريبار العقيمة.

إزالة جميع المتوسطة من الآبار واستبدال كل من متوسط ثقافة السفينة و وعائية تنبت المتوسطة في الآبار المقابلة. ضع لوحة microfluidic مرة أخرى إلى الحاضنة لمواصلة تنبت angiogenic. في اليوم السادس، كرر التصوير لدراسة نفاذية.

لإصلاح ثقافة الخلية، التبخر جميع وسائل الإعلام الثقافة من الآبار. إضافة 25 ميكرولترات من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني لجميع مدخل الضخ وآبار منفذ. ثم ضع جانبًا واحدًا من لوحة microfluidic على الغطاء بزاوية طفيفة من خمس درجات للحث على التدفق.

احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، الطامح PFA من الآبار. غسل جميع مداخل ضخ ومنافذ مرتين مع 50 ميكرولترات من HBSS.

ثم استلهمي الـ HBSS من الآبار Paraformaldehyde هو مادة كيميائية خطرة التي ينبغي التعامل معها ارتداء قفازات وفتح فقط في غطاء الدخان. بعد ذلك ، أضف 50 ميكروليتر من 0.2٪ من السطح غير الأيونيك لجميع مداخل الضخ ومنافذ permeabilize في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ووضع لوحة microfluidic على الغطاء بزاوية طفيفة من خمس درجات.

التعرق السطحي غير الأيونية من الآبار وغسل قنوات الضخ مرتين عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من HBSS إلى كل مدخل الضخ وآبار منفذ. الطامح HBSS من الآبار. إعداد Hoechst 1، 000 إلى 2، 000 لتلطيخ النوى وإعداد Phalloidin 100 إلى 200 في HBSS لتلطيخ F-actin.

الجمع بين ستة ملليلتر من HBSS، 30 ميكرولترات من F-actin، وثلاثة ميكرولترات من Hoechst في أنبوب فالكون. ثم إضافة 25 ميكروليتر إلى كل مدخل ضخ ومنفذ جيدا. ضع الطبق تحت زاوية طفيفة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.

غسل مرتين مع 50 ميكرولترات من HBSS في جميع مداخل ضخ ومنافذ. ثم صورة مباشرة باستخدام المجهر الفلورسنت مع مرحلة الآلي أو تخزين لوحة محمية من الضوء في أربع درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. وفي هذا البروتوكول، كانت الأوعية الصغيرة تُطعَّم باستمرار وتعرضها لتدرج عوامل نمو أوعية.

وأدى بذرة الـ IPSC-ECs باستخدام طريقة الضخ السلبي إلى كثافات البذر المتجانسة. يظهر الوقت من القطيرة التي يتم وضعها على رأس مدخل القناة microfluidic قطرات الحق بعد إضافة, القطرة على رأس الجذع مدخل بعد إضافة, حتى تم تثبيت الغضروف المفصلي قطرة من قبل مدخل مما أدى إلى تدفق نحو منفذ. وأدى التعرض لتدرج من العوامل الوعائية في براعم أوعية الاتجاه من الأوعية الدقيقة داخل الكولاجين منقوشة هلام واحد.

واضح تشكيل خلية طرف وغزو في الكولاجين كان هلام واحد مرئية بعد 24 ساعة من إضافة التدرج angiogenic في حين أن خلايا المخزون بما في ذلك تشكيل التجويف كانت مرئية بعد 48 ساعة. بعد التثبيت والتلطيخ ، تم تحديد شكل وطول هذه البراعم. ومع ذلك، دون إضافة عوامل النمو، لم يتم ملاحظة أي غزو في الكولاجين هلام واحد.

مع التصوير confocal، تم تحديد قطر براعم وتم تأكيد تشكيل التجويف. ويمكن استخدام هذه الطريقة لفحص مثبطات جديدة أوعية. وهذا يمكن أن يساعد على إيجاد علاجات جديدة ضد اعتلال الشبكية السكري والتهاب المفاصل الروماتويدي والسرطان.

ونحن حاليا نستكشف كيف يمكننا خلق الثقافات المشتركة بما في ذلك نموذج للحاجز الدموي في الدماغ والأعضاء الوعائية.