تحديد كمية النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية في الجسم الحي وتوصيف الضامة المشتقة من خلايا الدم
أغسطس 12, 2019
هنا نقدم بروتوكولا لقياس النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية الدم في نماذج الماوس، لتقييم آثار التدخلات الغذائية والدوائية والوراثية على خلايا الدم وتوصيف خلايا الدم المستمدة من الضامة في نماذج الماوس باستخدام monocyte-chemoattractant البروتين-1 (MCP-1) محملة الطابق السفلي غشاء المستمدة من المقابس هلام.
هذه المنهجية تسمح لنا بتحديد النشاط الكيميائي لـ monocyte الدم في الحيوانات الحية ودراسة تأثير الوجبات الغذائية الفقيرة على وظيفة أحادية الولود وآلياتها الأساسية. يمكن عزل الضامة المشتقة من أحادية الكيس وتحليلها باستخدام أساليب مختلفة ، بما في ذلك خلية واحدة ، وتقنيات omics التي توفر لقطة من صحة موقع أحادية الدم في نماذج الماوس. إجراء اليوم سيتم من قبل الدكتور يونغ جو آهن أستاذ مساعد في مختبري، والدكتور لوكسي وانغ، ما بعد الدكتوراه في مختبري.
قبل البدء في الإجراء، وتنظيف غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية مع مطهر وذوبان تماما عامل النمو انخفاض الطابق السفلي غشاء مشتقة من حل على الجليد. تجهيز الفردية المعقمة المحاقن ملليلتر واحد مع 26 الإبر قياس ووضع الإبر على الجليد. بمجرد أن يذوب الحل ، امسح الجزء العلوي من قارورة الحل المشتقة من الغشاء السفلي مع مسحة كحولية قبل تحميل 500 لتر صغير من الحل المكملة أو بدون جذب العلاج الكيميائي في كل حقنة ملليلتر واحدة.
ثم إزالة أي فقاعات الهواء من محلول الغشاء المشتقة من الطابق السفلي حقنة محملة لضمان تشكيل المكونات موحدة. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، قم بضخ حجم كامل من محلول الغشاء المشتق من الطابق السفلي دون إضافة MCP-1 في حوالي 100 لتر ميكرو في الثانية تحت الجلد في الجناح الأيمن من الفأر المُقصّر. وكامل 500 ميكرو لتر من محلول الغشاء المشتق من الطابق السفلي تكملها MCP-1 في الجناح الأيسر من الحيوان.
عقد حقنة في مكان 20 إلى 30 ثانية بعد الحقن لمنع تسرب من الحل والسماح واحد، قابس هلام على نحو سلس لتشكيل قبل وضع الماوس على وسادة الاحترار مع رصد حتى الشفاء الكامل. بعد ثلاثة أيام من الحقن، قم بإزالة الشعر الظهري من حقن المكونات واستخدام ملقط لفهم الجلد حول الفقرات الصدرية والقلومية العليا. جعل شق مليمترين طويلة في الجلد وقطع على طول خط الوسط من الجزء الخلفي من الفأر من فقرات عنق الرحم وصولا الى سنتيمتر واحد فوق تقاطع العمود الفقري الدلل.
فصل الجلد من طبقة العضلات، دبوس أسفل الجلد على منصة رغوة البوليسترين. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، فهم بعناية كبسولة ليفية تحتوي على قابس هلام مشتق من الغشاء السفلي واستخدام ملقط غرامة لإزالة كبسولة ليفية. ثم استخدام مقص غرامة لتنظيف المكونات.
ثم نقل المكونات الغشاء المستخلصة من الطابق السفلي تنظيفها في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر المسمى بشكل مناسب ووزنها. Reweigh أنبوب لحساب وزن المكونات هلام الغشاء المشتقة من الطابق السفلي. بالنسبة للتخلص من المكونات المكونات الغشاء الطابق السفلي، واستخدام مقص غرامة نظيفة ل mince المكونات هلام الغشاء الطابق السفلي في كل أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة وإضافة 800 لتر صغير من المشردين إلى المقابس.
دوامة في السرعة القصوى لمدة 10 ثوان لتعطيل المقابس ووضع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين في خلاط حراري في 1400 دوران في الدقيقة الواحدة لإذابة تماما المقابس هلام الغشاء الطابق السفلي. في نهاية الحضانة، الرواسب شظايا المكونات عن طريق الطرد المركزي مرتين وإعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. نقل 50 ميكرولترات من كل تعليق الخلية في أنابيب جديدة أجهزة الطرد المركزي الصغيرة وتسمية الخلايا في أنابيب جديدة مع 0.5 ميكرولترات من الكالسين.
بعد حضانة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون، عد عدد الخلايا الفلورية الخضراء الحية إيجابية وميتة غير فلورية الخلايا على عداد الخلايا الآلي. لتحليل بقعة الغربية خلية واحدة، إضافة ملليلتر واحد من تعليق خلية واحدة مخففة إلى رقاقة لطخة الغربية خلية واحدة في الجزء السفلي من طبق بتري 10 سم. بعد خمس إلى 15 دقيقة، تفحص الرقاقة تحت المجهر البراينفيلد.
وينبغي أن تشغل خلية واحدة ما يقرب من 15 إلى 20 في المائة من الآبار الصغيرة، وينبغي أن يحتوي أقل من اثنين في المائة من الآبار على خليتين أو أكثر. إذا تم تحميل الشريحة بشكل صحيح، إمالة الطبق 45 درجة وغسل رقاقة ثلاث مرات مع العازلة تعليق لإزالة أي خلايا غير مُلخص. بعد الغسيل الأخير ، بعناية وتحميل الرقاقة في الخلية الكهربائية من أداة غربية خلية واحدة ، هلام الجانب ، وتغطية رقاقة لطخة الغربية الخلية الواحدة بأكملها مع تحلل تشغيل المخزن المؤقت.
بدء خلية تحلل وتشغيل الصك وفقا لمعلمات التجربة المناسبة. في نهاية الشوط ، شطف رقاقة مع اثنين من غسل 10 دقيقة مع عازلة الغسيل الطازجة في غسل في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الثاني، إضافة 80 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الأولية التي تهم غرفة التحقيق الأجسام المضادة وخفض رقاقة هلام الجانب إلى أسفل بحيث الفتائل حل الأجسام المضادة عبر رقاقة.
بعد ساعتين في درجة حرارة الغرفة، وغسل رقاقة ثلاث مرات في الغسيل العازلة مرة واحدة في الماء على شاكر. احتضان الرقاقة مع جسم مضاد ثانوي مناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل رقاقة ثلاث مرات مع العازلة الغسيل وتدور رقاقة على الدوار الشريحة لإزالة أي العازلة الغسيل المتبقية.
لتجريد رقاقة لطخة غربية من خلية واحدة، ضع رف أنبوب 15 ملليلتر في حمام مائي 60 درجة مئوية مع الماء بسنتيمتر واحد فقط فوق الرف. في غطاء الدخان، إضافة 40 ملليلتر من تجريد العازلة و 320 ميكرولترات من بيتا morcepta الإيثانول إلى علبة. ضع الرقاقة في طبق بتري طوله 10 سنتيمترات داخل العبوة وختم العبوة باستخدام Parafilm.
ثم ضع العبوة داخل رف الأنبوب في حمام الماء. بعد 90 دقيقة، نقل بعناية رقاقة في طبق بتري جديد وغسل لفترة وجيزة رقاقة مرة واحدة مع عازلة غسل قبل إضافة 15 ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة إلى طبق بتري لغسل 15 دقيقة على شاكر. في هذه التجربة التمثيلية، تم حساب الخلايا التي تم تجنيدها في كل القابس بعد الحقن بعد يوم وثلاثة وخمسة أيام.
عن طريق طرح عدد الخلايا في المقابس محملة بالمركبات من عدد الخلايا في المقابس محملة MCP-1، ثم تم حساب عدد الخلايا التي تم تجنيدها خصيصا استجابة لجذب العلاج الكيميائي. ولوحظت عملية تجنيد وتراكم خلايا محددة معجلة من نوع MCP-1 على مدى فترة الأيام الخمسة، حيث زادت المعدلات من 000 31 خلية يوميا بعد يوم واحد من الحقن إلى ما يصل إلى 000 136 خلية يوميا، أي بعد خمسة أيام من الحقن. ثم استخدم تحليل لطخة الغربية خلية واحدة لتحديد أنواع الخلايا المختلفة التي تم تجنيدها في المقابس المشتقة من الغشاء السفلي ، وفقًا لتعبيرها عن علامات الخلايا المناعية المحددة ذات الاهتمام.
على سبيل المثال، كانت النسبة المئوية للوحديات الأحادية داخل مقابس الجل المشتقة من الغشاء السفلي من نوع MCP-1 منخفضة في اليوم الأول وبلغت ذروتها في اليوم الثالث قبل أن تنخفض مرة أخرى في اليوم الخامس، في حين زادت أعداد الضامة بشكل مطرد طوال فترة الدراسة. بالنسبة للمقابس المحملة MCP-1، كانت النسبة المئوية للوحددات بالإضافة إلى الضامة داخل مجموعة الخلايا المعزولة هي الأعلى في اليوم الثالث، مما يشير إلى أنه بعد ثلاثة أيام، كانت الغالبية العظمى من الخلايا التي تم توظيفها بواسطة chemotaxis التابع لـ MCP-1 أحادية و الضامة. على الرغم من أن العدد الإجمالي للخلود الأحادية بالإضافة إلى الضامة هو عادة أعلى في اليوم الخامس مقارنة باليوم الثالث ، فإن عدد الخلايا في اليوم الثالث يعكس بدقة أكبر الدم المحيطي من chemotaxis أحادية الخلايا والتوظيف ، وبالتالي يوصى باليوم الثالث لتحليل المكونات الغشاء المباشر للطابق السفلي.
يعتمد الحصول الناجح على خلايا مفردة لتحليل المصب على دقة الحقن والإزالة الكاملة للمقاطق. يمكن استخدام عملية تدفق الخلايا الخلوية، أو خلية وحيدة من النشاف الغربي، أو الجزء الأكبر، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، وإجراءات أخرى من إجراءات omics لتقييم الخصائص والنمط الظاهري للضامة أحادية المواصفات والمستمدة من أحادية الخلايا.
النظرة العامة
يعرض هذا المقال بروتوكولًا لتحديد النشاط الكيميائي لخلايا البلاعم أحادية النواة في الدم في نماذج الفئران. يقيم تأثير التدخلات المختلفة على وظيفة الخلايا أحادية النواة ويصّف البلاعم المشتقة من الخلايا أحادية النواة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- نماذج الفئران
الخلفية
- تلعب الخلايا أحادية النواة في الدم دورًا حاسمًا في الاستجابة المناعية.
- فهم نشاطها الكيميائي يمكن أن يكشف رؤى حول حالات صحية مختلفة.
- البلاعم المشتقة من الخلايا أحادية النواة مهمة لدراسة الوظائف المناعية.
- يسمح هذا البروتوكول بدراسة سلوك الخلايا أحادية النواة في الجسم الحي.
هدف الدراسة
- لتحديد النشاط الكيميائي لخلايا البلاعم أحادية النواة في الدم.
- لتقييم تأثيرات التدخلات التغذوية والدوائية والجيني.
- لتوصيف البلاعم المشتقة من الخلايا أحادية النواة.
الطرق المستخدمة
- حقن سدادات هلامية محملة بـ MCP-1 في نماذج الفئران.
- عزل وتحليل البلاعم المشتقة من الخلايا أحادية النواة.
- تقنيات الخلية الواحدة وعلم الأحياء المجموعي للتحليل المفصل.
- عد الخلايا وتحليل Western blot لتقييم الوظائف.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لنشاط الخلايا أحادية النواة الكيميائي.
- رؤى حول تأثيرات النظام الغذائي على وظيفة الخلايا أحادية النواة.
- توصيف الحالة الصحية للخلايا أحادية النواة في الدم.
- طريقة مثبتة لعزل وتحليل البلاعم.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة سلوك الخلايا أحادية النواة.
- يمكن تطبيقه على تدخلات مختلفة تؤثر على الاستجابة المناعية.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه المنهجية لاستكشاف الأمراض المرتبطة بالخلايا أحادية النواة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantifying monocyte chemotactic activity in vivo provides a functional biomarker for assessing monocyte priming and dysfunction linked to metabolic disorders. This approach enables preclinical evaluation of diet-induced immune dysregulation and supports target validation in inflammatory disease models. The methodology facilitates isolation and phenotypic characterization of recruited monocyte-derived macrophages for mechanistic de-risking in atherosclerosis and obesity research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures functional monocyte chemotaxis as a biomarker for priming and dysfunction in metabolic disease models.
- Operational Value: Enables isolation of live macrophages from gel plugs for downstream single-cell Western blot analysis.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing of chemokine-driven monocyte recruitment in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Quantifies chemoattractant-specific cell recruitment by subtracting vehicle-loaded plug counts from MCP-1-loaded plug counts.
- Operational Value: Generates reproducible temporal recruitment profiles (day 1, 3, 5) to define optimal analysis windows.
- Strategic Value: Provides standardized readouts for comparing monocyte responses across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes macrophage phenotype and activation profiles derived from recruited monocytes.
- Operational Value: Permits application of omics techniques (flow cytometry, RNA sequencing) to isolated macrophages.
- Strategic Value: Links monocyte dysfunction to chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling functional assessment of monocyte behavior prior to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses regarding chemokine-mediated monocyte recruitment and macrophage differentiation.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved chemotactic readouts for compound or intervention screening.
- Analytics: Supplies single-cell resolution data on immune cell composition and marker expression via Western blot.
- Translational Research: Connects monocyte phenotypes to disease-relevant outcomes in metabolic inflammation models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating immunomodulatory effects across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking monocyte chemotaxis to macrophage phenotype and function.
- Operational Value: Standardizes plug formation, isolation, and cell recovery procedures for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early signs of monocyte dysfunction in disease models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on monocyte recruitment and macrophage polarization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical procedures and gel plug handling.
- Depends on access to single cell Western blot instrumentation and associated reagents.
- Necessitates standardized chemoattractant preparation and plug quantification protocols.
- Involves optimization of cell isolation efficiency from fibrous capsules.
- Limited by the technical complexity of plug removal and single-cell loading efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Preparation of the Monocyte Chemoattractant Protein (MCP)-1-loaded Growth Factor-reduced Basement Membrane-derived Solution
1:40
Basement Membrane-derived Solution Injection and Gel Plug Harvest
3:29
Basement Membrane-derived Gel Plug Digestion
4:43
Single-cell Western Blot (scWB) Analysis
6:38
scWB Chip Stripping
7:35
Results: Representative Basement Membrane-derived Gel Plug Cell Recruitment Analyses
9:22
Conclusion
