جيل من الأعضاء الورم من نماذج الماوس المهندسة وراثيا من سرطان البروستاتا
يونيو 13, 2019
نعرض طريقة لتشريح وتشريح نماذج سرطان البروستاتا الماوس، مع التركيز على تشريح ورم البروستاتا. كما يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد الأعضاء ورم البروستاتا الماوس.
الثقافات الماوس organoid تشبه بشكل أوثق في منظمة خلية الجسم الحي من الثقافات الخلية التقليدية. في أبحاث السرطان, العضيات نموذج الورم الأصلي أفضل من خطوط الخلايا 2D ويمكن استخدامها لاختبار علاجات السرطان المحتملة في المختبر لتطوير علاجات المخدرات الجديدة. لاستخراج كتلة من الذكور الماوس الجهاز البولي التناسلي فهم وسادة الدهون على جانبي المثانة وسحب صعودا لفضح الخصية.
تشريح بعناية كل الخصية بعيدا عن بقية المنطقة البولية التناسلية. رفع بلطف المثانة بحيث يتم رفع المنطقة البولي التناسلية معا، مما يعرض مجرى البول تحتها. أثناء الإمساك بالمثانة، وجه المقص ضد الجانب السفلي من البروستاتا الظهرية لـ incise مجرى البول.
سيتم إطلاق منطقة البولي التناسلي بأكملها من تجويف البطن. بعد إزالة الجهاز البولي التناسلي، سيتم تعريض العقد اللمفاوية الحوضية المتمركزة مباشرة خلف الجهاز البولي التناسلي وعلى جانبي العمود الفقري. لإزالة الغدد الليمفاوية الملمية المزالط المستقيمة تحت النسيج الليمفاوي وسحب ما يصل.
بعد ذلك ، فهم المستقيم مع ملقط مستقيم وقطع ، وسحب ما يصل على المستقيم لكشف القولون كله والأمعاء الدقيقة للبحث عن الآفات النقيلي في العقد الليمفاوية mesenteric. عندما تم إزالة ilium كامل الاستمرار في سحب على الاثنيع لفضح المعدة. قطع المريء لإزالة المعدة تماما.
إذا لوحظ أي آفات النقيلي في العقد الليمفاوية، تشريح بعناية هذه العقد بعيدا عن الأمعاء لتخزين في برنامج تلفزيوني. عندما تمت إزالة المعدة ، يمكن حصاد الطحال من الجانب الظهري من البطن للتخزين في 4 ٪ شبهفورمالدهيد. إزالة الكبد لتخزين في برنامج تلفزيوني.
إزالة الكلى من جانبي العمود الفقري جنبا إلى جنب مع أي الغدد الليمفاوية الكلوية التي تحتوي على الآفات النقيلي. لفضح تجويف الصدر قطع بعناية الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري. الضغط السلبي الذي يتم إطلاقه داخل تجويف الصدر سوف يعرض القلب والرئتين.
سحب ما يصل على القص لفتح تجويف الصدر كذلك. مسح الوجه البطني للتجويف الصدري على طول القفص الصدري بحثا عن الآفات النقيلي في الغدد الليمفاوية الصدرية للتشريح إذا كان موجودا. بينما لا يزال عقد القص، وقطع بعيدا القفص الصدري البطني للوصول إلى القلب والرئتين وسحب ما يصل على القلب لقطع تحت الرئتين.
لإزالة القلب والرئتين في كتلة قطع كل من الأوعية الدموية الأمامية في القصبة الهوائية. نقل القلب بعناية دون إتلاف أنسجة الرئة أو الآفات النقيلي الرئة في حاوية من برنامج تلفزيوني. لتشريح ورم البروستاتا مكان المنطقة البولية التناسلية تحت مجهر تشريح.
استخدم زوجًا من ملقط مستقيم وزوج من ملقط منحنية لقلب منطقة البولي التناسلية على سطحها الظهري. حدد موقع منطقة البروستاتا القريبة التي يمكن تحديدها بواسطة اللون الوردي والأحمر من مجرى البول. فهم مجرى البول بقوة للسماح للتلاعب في الأنسجة البولي التناسلية مع ملقط المنحني.
حدد موقع قاعدة من الـ(هينيولات) للسماح بإزالتها بعناية ثم استخدام الجانب المنحني من ملقط لإزالة المزهريات والأنسجة الدهنية والزام أكبر قدر ممكن. في حين لا يزال عقد بحزم في منطقة مجرى البول والبروستاتا القريبة، واستخدام زوج من مقص مدبب غرامة لإزالة المثانة من مجرى البول.
عقد منطقة البروستاتا القريبة ومجرى البول بقوة مع ملقط على التوالي فهم منطقة البروستاتا الأمامية مع الجانب المنحني من ملقط لسحب بحزم الأنسجة بعيدا عن المثانة وبقية البروستاتا. ضع أنسجة البروستاتا الأمامية في PBS وحدد موقع منطقة البروستاتا البطنية. إزالة منطقة البروستاتا البطنية بنفس الطريقة.
إذا كان يمكن تمييز المنطقة الجانبية عن المنطقة الظهرية إزالة منطقة البروستاتا الجانبية على كلا الجانبين. ثم إزالة منطقة البروستاتا الظهرية ووضع منطقة البروستاتا القريبة في 4٪ شبهformaldehyde. بعد الرامز ، ضع قطع الورم في أنبوب 15 ملليلتر من عازلة الهضم لعملية الهضم من ساعة ونصف إلى ساعتين في 37 درجة مئوية.
في نهاية عملية الهضم، رواسب الأنسجة المهضمة عن طريق الطرد المركزي والتخلص من اهب. نفض الغبار الأنبوب لتخفيف بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من التربسين قبل الدافئة تكملها 10 ميكرومولار Y-27632 روك المانع لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة إعادة تثاؤب الأنسجة خمس مرات مع تلميح P1000 ماصة القياسية. العودة أنبوب إلى حمام الماء لمدة خمس دقائق إضافية الحضانة والتثاب. لطلاء قبة مصفوفة غسل الخلايا المهضوضة في تسعة ملليلتر من المتوسط البارد، ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
إعادة تثبيت الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة للعد. وبعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرة أخرى. تمييع الخلايا السرطانية في الحجم المناسب من المصفوفة.
إسقاط بعناية 200 ميكرولترات من حل الخلية مصفوفة في كل بئر من 55 درجة مئوية درجة حرارة ستة بئر لوحة. السماح للقباب لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين قبل وضع لوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. عندما تكون القباب قد توطدت تماما إضافة ملليلتر اثنين من وسط البروستاتا organoid تكملة مع الاندروجين R1881 ومثبط روك لكل بئر.
إعادة لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية. تكشف صور تشريح الفلورسنت عن البروتين الفلوري الأخضر، أو تعبير GFP، عن طريق أورام البروستاتا الصلبة، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية تعبر عن Cre. الكبد والرئتين من نفس الحيوان المعرض الأورام النقيلي التعبير عن GFP مما يدل على أن هذه الأورام نشأت من ورم البروستاتا الأولية.
العقدة الليمفاوية الحوض من هذا الماوس يعبر عن GFP وليس الطماطم، مشيرا إلى أن هذا الورم النقيلي قد تجاوزت العقدة الليمفاوية ولا يبقى أي أنسجة طبيعية. في اليوم واحد من العضيات الصغيرة ولدت من ورم البروستاتا الصلبة تبدأ في تشكيل مع كل من الطماطم والخلايا التي تعبر عن GFP الموجودة في ثقافة الورم الجهاز. بحلول اليوم السابع وما بعده عندما تكون الأورام العضوية في البروستاتا قد تشكلت بالكامل ومع ذلك ، فإن الأعضاء تعبر عن GFP ، ولكن ليس الطماطم ، مما يشير إلى أن الأعضاء قد نشأت من الخلايا السرطانية الصريحة وليس من الخلايا الظهارية العادية.
في اليوم الأول من ثقافة الأعضاء الصغيرة التي تم إنشاؤها من ورم البروستاتا المليئة بالسوائل على حد سواء الطماطم والخلايا المعبرة عن GFP موجودة داخل الثقافة العضوية. Organoids من أورام البروستاتا مملوءة بالسوائل تعبر عن أي من GFP أو الطماطم في اليوم السابع وما بعده ومع ذلك ، مشيرا إلى أن الأعضاء تشكلت من الخلايا التي لا تعبر عن Cre. للبقاء موجهة عند حصاد أنسجة البروستاتا، تكون على بينة من المثانة ومزهاء البول في جميع الأوقات.
بعد جيلهم يمكن استخدام الأعضاء في تطبيقات التصوير وتحليل البيولوجيا الجزيئية وشاشات الأدوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتشريح الجثة وتشريح نماذج سرطان البروستاتا للفئران، مع التركيز على تشريح ورم البروستاتا. كما توضح أيضًا بروتوكولاً خطوة بخطوة لتوليد كائنات ورم البروستاتا للفئران.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- طب الأورام
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تحاكي ثقافات الكائنات الحية الدقيقة تنظيم الخلايا في الجسم الحي بشكل أقرب من ثقافات الخلايا التقليدية.
- تعتبر الكائنات الحية الدقيقة نماذج فعالة للأورام الأصلية في أبحاث السرطان.
- يمكن استخدامها لاختبار علاجات السرطان المحتملة في المختبر.
- تهدف هذه الدراسة إلى تطوير علاجات دوائية جديدة باستخدام نماذج الكائنات الحية الدقيقة.
غرض الدراسة
- لتوضيح طريقة لتجزئة نماذج سرطان البروستاتا للفئران.
- لتوفير بروتوكول لتوليد كائنات حية دقيقة لورم البروستاتا.
- لتعزيز فهم بيولوجيا الورم من خلال نماذج الكائنات الحية الدقيقة.
الطرق المستخدمة
- الاستخراج الكلي لنظام الجهاز البولي التناسلي للفأر الذكر.
- تشريح الخصيتين والمثانة لكشف البروستاتا.
- شق مجرى البول باستخدام المقص أثناء تثبيت المثانة.
- بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد الكائنات الحية الدقيقة.
النتائج الرئيسية
- تقنيات تشريح ناجحة لنماذج سرطان البروستاتا للفئران.
- توليد كائنات دقيقة تشبه إلى حد كبير الأورام الأصلية.
- توضيح الكائنات الحية الدقيقة كمنصة لاختبار العلاجات.
- فهم محسن لبيولوجيا سرطان البروستاتا.
الاستنتاجات
- الطرق المقدمة فعالة لدراسة سرطان البروستاتا.
- توفر الكائنات الحية الدقيقة أداة قيّمة لأبحاث السرطان.
- قد يؤدي هذا النهج إلى استراتيجيات علاجية محسنة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Genetically engineered mouse models of prostate cancer provide a physiologically relevant system for studying tumorigenesis and therapeutic response. Combining these models with 3D tumor organoid culture enables in vitro systems that recapitulate tumor architecture and support drug screening. This approach improves predictive confidence in preclinical oncology research by bridging genetic models with functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor suppressor loss in prostate cancer using Cre-loxP models to validate genetic targets.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate tumor tissue from GEMMs for downstream organoid generation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates tumor organoids that maintain GFP expression from Cre-recombined tumor cells, enabling lineage tracking in drug response assays.
- Operational Value: Establishes a standardized 3D culture protocol using matrix domes and prostate organoid medium with R1881 and ROCK inhibitor for consistent tumor model propagation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports comparison of tumor and normal epithelial organoids via dual Tomato/GFP expression to assess tumor-specific phenotypes.
- Operational Value: Facilitates metastatic lesion detection in lymph nodes and organs during necropsy, informing preclinical models of cancer progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates genetic model dissection with 3D culture to support discovery biology, assay development, and translational validation in prostate cancer research.
- Discovery Biology: Enables functional validation of tumor suppressor pathways through Cre-dependent recombination in prostate-specific GEMMs.
- Screening: Produces organoid cultures suitable for drug screening applications after solidification and medium addition.
- Analytics: Allows fluorescence-based tracking of Cre activity (GFP) and recombination history (Tomato) to distinguish tumor-derived from normal epithelial organoids.
- Translational Research: Supports continuity from autochthonous tumor models to ex vivo drug testing via organoid platforms that retain genetic lineage markers.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable necropsy and organoid generation workflow applicable across multiple GEMMs and cancer types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by linking genetic models to functional 3D phenotypes that reflect in vivo tumor behavior.
- Operational Value: Standardizes tumor tissue processing and organoid formation to improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Reduces reliance on 2D cell lines by providing genetically defined, microenvironment-informed models for preclinical testing.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates using organoid models that retain tumor-specific genetic signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse necropsy, prostate dissection, and fluorescence tissue identification.
- Dependent on dissection microscopy, centrifuges, pipettes, and temperature-controlled water baths for tissue processing.
- Necessitates standardized organoid medium supplemented with androgen R1881 and Y-27632 ROCK inhibitor for consistent culture.
- Requires adaptation of digestion and trituration steps based on tumor tissue consistency from different GEMMs.
- Limited by the need for fresh tissue processing post-necropsy to maintain organoid viability and genetic fidelity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
En Bloc Male Urogenital System Extraction
1:08
Pelvic Lymph Node, Spleen, Liver, Kidney, Lung, Tibia, and Femur Extraction
3:16
Prostate Tumor Dissection
5:17
Tumor Tissue Digestion
6:07
Matrix Dome Plating
7:07
Results: Representative Solid and Fluid-filled Tumor Characterization
8:28
Conclusion
