جيل من الأعضاء الورم من نماذج الماوس المهندسة وراثيا من سرطان البروستاتا

الثقافات الماوس organoid تشبه بشكل أوثق في منظمة خلية الجسم الحي من الثقافات الخلية التقليدية. في أبحاث السرطان, العضيات نموذج الورم الأصلي أفضل من خطوط الخلايا 2D ويمكن استخدامها لاختبار علاجات السرطان المحتملة في المختبر لتطوير علاجات المخدرات الجديدة. لاستخراج كتلة من الذكور الماوس الجهاز البولي التناسلي فهم وسادة الدهون على جانبي المثانة وسحب صعودا لفضح الخصية.

تشريح بعناية كل الخصية بعيدا عن بقية المنطقة البولية التناسلية. رفع بلطف المثانة بحيث يتم رفع المنطقة البولي التناسلية معا، مما يعرض مجرى البول تحتها. أثناء الإمساك بالمثانة، وجه المقص ضد الجانب السفلي من البروستاتا الظهرية لـ incise مجرى البول.

سيتم إطلاق منطقة البولي التناسلي بأكملها من تجويف البطن. بعد إزالة الجهاز البولي التناسلي، سيتم تعريض العقد اللمفاوية الحوضية المتمركزة مباشرة خلف الجهاز البولي التناسلي وعلى جانبي العمود الفقري. لإزالة الغدد الليمفاوية الملمية المزالط المستقيمة تحت النسيج الليمفاوي وسحب ما يصل.

بعد ذلك ، فهم المستقيم مع ملقط مستقيم وقطع ، وسحب ما يصل على المستقيم لكشف القولون كله والأمعاء الدقيقة للبحث عن الآفات النقيلي في العقد الليمفاوية mesenteric. عندما تم إزالة ilium كامل الاستمرار في سحب على الاثنيع لفضح المعدة. قطع المريء لإزالة المعدة تماما.

إذا لوحظ أي آفات النقيلي في العقد الليمفاوية، تشريح بعناية هذه العقد بعيدا عن الأمعاء لتخزين في برنامج تلفزيوني. عندما تمت إزالة المعدة ، يمكن حصاد الطحال من الجانب الظهري من البطن للتخزين في 4 ٪ شبهفورمالدهيد. إزالة الكبد لتخزين في برنامج تلفزيوني.

إزالة الكلى من جانبي العمود الفقري جنبا إلى جنب مع أي الغدد الليمفاوية الكلوية التي تحتوي على الآفات النقيلي. لفضح تجويف الصدر قطع بعناية الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري. الضغط السلبي الذي يتم إطلاقه داخل تجويف الصدر سوف يعرض القلب والرئتين.

سحب ما يصل على القص لفتح تجويف الصدر كذلك. مسح الوجه البطني للتجويف الصدري على طول القفص الصدري بحثا عن الآفات النقيلي في الغدد الليمفاوية الصدرية للتشريح إذا كان موجودا. بينما لا يزال عقد القص، وقطع بعيدا القفص الصدري البطني للوصول إلى القلب والرئتين وسحب ما يصل على القلب لقطع تحت الرئتين.

لإزالة القلب والرئتين في كتلة قطع كل من الأوعية الدموية الأمامية في القصبة الهوائية. نقل القلب بعناية دون إتلاف أنسجة الرئة أو الآفات النقيلي الرئة في حاوية من برنامج تلفزيوني. لتشريح ورم البروستاتا مكان المنطقة البولية التناسلية تحت مجهر تشريح.

استخدم زوجًا من ملقط مستقيم وزوج من ملقط منحنية لقلب منطقة البولي التناسلية على سطحها الظهري. حدد موقع منطقة البروستاتا القريبة التي يمكن تحديدها بواسطة اللون الوردي والأحمر من مجرى البول. فهم مجرى البول بقوة للسماح للتلاعب في الأنسجة البولي التناسلية مع ملقط المنحني.

حدد موقع قاعدة من الـ(هينيولات) للسماح بإزالتها بعناية ثم استخدام الجانب المنحني من ملقط لإزالة المزهريات والأنسجة الدهنية والزام أكبر قدر ممكن. في حين لا يزال عقد بحزم في منطقة مجرى البول والبروستاتا القريبة، واستخدام زوج من مقص مدبب غرامة لإزالة المثانة من مجرى البول.

عقد منطقة البروستاتا القريبة ومجرى البول بقوة مع ملقط على التوالي فهم منطقة البروستاتا الأمامية مع الجانب المنحني من ملقط لسحب بحزم الأنسجة بعيدا عن المثانة وبقية البروستاتا. ضع أنسجة البروستاتا الأمامية في PBS وحدد موقع منطقة البروستاتا البطنية. إزالة منطقة البروستاتا البطنية بنفس الطريقة.

إذا كان يمكن تمييز المنطقة الجانبية عن المنطقة الظهرية إزالة منطقة البروستاتا الجانبية على كلا الجانبين. ثم إزالة منطقة البروستاتا الظهرية ووضع منطقة البروستاتا القريبة في 4٪ شبهformaldehyde. بعد الرامز ، ضع قطع الورم في أنبوب 15 ملليلتر من عازلة الهضم لعملية الهضم من ساعة ونصف إلى ساعتين في 37 درجة مئوية.

في نهاية عملية الهضم، رواسب الأنسجة المهضمة عن طريق الطرد المركزي والتخلص من اهب. نفض الغبار الأنبوب لتخفيف بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من التربسين قبل الدافئة تكملها 10 ميكرومولار Y-27632 روك المانع لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة إعادة تثاؤب الأنسجة خمس مرات مع تلميح P1000 ماصة القياسية. العودة أنبوب إلى حمام الماء لمدة خمس دقائق إضافية الحضانة والتثاب. لطلاء قبة مصفوفة غسل الخلايا المهضوضة في تسعة ملليلتر من المتوسط البارد، ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

إعادة تثبيت الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة للعد. وبعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرة أخرى. تمييع الخلايا السرطانية في الحجم المناسب من المصفوفة.

إسقاط بعناية 200 ميكرولترات من حل الخلية مصفوفة في كل بئر من 55 درجة مئوية درجة حرارة ستة بئر لوحة. السماح للقباب لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين قبل وضع لوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. عندما تكون القباب قد توطدت تماما إضافة ملليلتر اثنين من وسط البروستاتا organoid تكملة مع الاندروجين R1881 ومثبط روك لكل بئر.

إعادة لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية. تكشف صور تشريح الفلورسنت عن البروتين الفلوري الأخضر، أو تعبير GFP، عن طريق أورام البروستاتا الصلبة، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية تعبر عن Cre. الكبد والرئتين من نفس الحيوان المعرض الأورام النقيلي التعبير عن GFP مما يدل على أن هذه الأورام نشأت من ورم البروستاتا الأولية.

العقدة الليمفاوية الحوض من هذا الماوس يعبر عن GFP وليس الطماطم، مشيرا إلى أن هذا الورم النقيلي قد تجاوزت العقدة الليمفاوية ولا يبقى أي أنسجة طبيعية. في اليوم واحد من العضيات الصغيرة ولدت من ورم البروستاتا الصلبة تبدأ في تشكيل مع كل من الطماطم والخلايا التي تعبر عن GFP الموجودة في ثقافة الورم الجهاز. بحلول اليوم السابع وما بعده عندما تكون الأورام العضوية في البروستاتا قد تشكلت بالكامل ومع ذلك ، فإن الأعضاء تعبر عن GFP ، ولكن ليس الطماطم ، مما يشير إلى أن الأعضاء قد نشأت من الخلايا السرطانية الصريحة وليس من الخلايا الظهارية العادية.

في اليوم الأول من ثقافة الأعضاء الصغيرة التي تم إنشاؤها من ورم البروستاتا المليئة بالسوائل على حد سواء الطماطم والخلايا المعبرة عن GFP موجودة داخل الثقافة العضوية. Organoids من أورام البروستاتا مملوءة بالسوائل تعبر عن أي من GFP أو الطماطم في اليوم السابع وما بعده ومع ذلك ، مشيرا إلى أن الأعضاء تشكلت من الخلايا التي لا تعبر عن Cre. للبقاء موجهة عند حصاد أنسجة البروستاتا، تكون على بينة من المثانة ومزهاء البول في جميع الأوقات.

بعد جيلهم يمكن استخدام الأعضاء في تطبيقات التصوير وتحليل البيولوجيا الجزيئية وشاشات الأدوية.