القياس الكمي لثلاثه آفات الحمض النووي عن طريق قياس الطيف الكتلي وتقييم مستوياتها في انسجه الفئران المعرضة للجسيمات الدقيقة المحيطة

تسمح الطرق المعروضة هنا بالتقدّم الكمي لآفات الحمض النووي المستحثة بالتأكسد، مما يساهم في فهم الآليات الفيزيولوجية المرضية التي قد تكون مستهدفة للوقاية من الأمراض وعلاجها. الانتقائية والحساسية هي المزايا الرئيسية. الانتقائية هي ميزة أساسية عند العمل مع العينات البيولوجية المعقدة.

HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب تطورت كمعيار الذهب لهذا النوع من الكم مع المصفوفات البيولوجية. الإجهاد التأاكسى هو حدث شائع لمختلف العمليات الفيزيولوجية. وقد تم الكشف عن زيادة مستويات الإدينو أدويتو في الأنسجة أو البول من المرضى الذين يعانون من أمراض التهابية.

كما توفر آفات الحمض النووي معلومات عن الأحداث المحلية الناجمة عن التعرض للملوثات. إذا تم زيادة آفات الحمض النووي، قد يكون التعرض على المستوى الذي يزيد من خطر الإصابة بالسرطان، على سبيل المثال. الآفات يمكن أن تكون كمية في الحمض النووي من أي نظام الخلوية وبدلا من ذلك في البول والبلازما، واللعاب ثقافة المتوسطة مع التكيف في إعداد العينة.

للبدء، استخدم لوحة الثقافة وضعت على الجليد كقاعدة لقطع قطعة من الأنسجة مع مشرط. تزن غرام واحد من الأنسجة في كل 50 ملليلتر توج أنبوب للاستخدام الفوري. الحفاظ على الأنسجة المتبقية على الجليد الجاف قبل تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.

إلى كل أنبوب، إضافة 10 ملليلتر من حل تحلل الخلايا التجارية التي تحتوي على 0.5 ميلمولار deferoxamine، والحفاظ على الجليد. تعيين التجانس الأنسجة إلى سرعة منخفضة، حوالي 60 إلى 90 دورة في الدقيقة. التجانس الأنسجة على الجليد لبضع دقائق حتى الحل هو من دون شظايا الأنسجة.

ثم، إضافة 150 ميكرولترات من محلول البروتينات K لكل عينة متجانسة. يهز الأنابيب عن طريق الانعكاس، والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في الصباح، إضافة 40 ميكرولترات من محلول ريبونوكليس A، يهز من قبل عكس، والحفاظ على الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

إضافة خمسة ملليلتر من محلول الترسيب البروتين التجاري، دوامة بقوة، والطرد المركزي في 2،000 مرات ز، أربع درجات مئوية، لمدة 10 دقائق. نقل supernatants إلى أنابيب توج 50 ملليلتر التي تحتوي على 10 ملليلتر من isopropanol الباردة. عكس الأنابيب بلطف عدة مرات حتى الملاحظة من الحمض النووي المترسب.

استخدام ماصة باستور مغلقة في نهاية لجمع الحمض النووي المترسب. نقل الحمض النووي التي تم جمعها إلى أنابيب تحتوي على أربعة ملليلترات من 10 ملليمولار تريس العازلة وd deferoxamine واحد ملليمولار في رقم هيدروكلوري سبعة إلى حل. بعد أن يذوب الحمض النووي تماما في الأنابيب، إضافة أربعة ملليلتر من محلول الكلوروفورم التي تحتوي على 4٪ من الكحول isoamyl إلى كل أنبوب.

عكس الأنابيب 10 مرات لتجانس, الطرد المركزي في 2,000 مرات ز, أربع درجات مئوية, لمدة 10 دقائق, ونقل المراحل العليا إلى أنابيب جديدة. كرر غسل المرحلة العليا مع محلول الكلوروفورم مرتين ازيد من ذلك. ثم، إضافة ثمانية ملليلتر من الإيثانول المطلق و 0.4 ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم خمسة المولر لتسريع الحمض النووي.

مرة أخرى، وجمع الحمض النووي المُعجل، ونقله إلى ثلاثة ملليلترات من الإيثانول 70٪. كرر غسل مع 70٪ الإيثانول مرة أخرى. تخلص من محلول الإيثانول بحذر، وعكس الأنابيب التي تحتوي على الحمض النووي المترسب على الورق الماص لإزالة محلول الفائض.

بعد إعداد عينات التحلل المائي للحمض النووي بمعيار 15N5 النظائري 1، N6-etheno-deoxyadenosine و15N5 النظائرية من 1، N2-etheno-deoxyguanosine وفقا للمخطوطة، نقل 10 ميكرومترات من كل عينة إلى أنابيب لتحديد كمي من deoxynucleides العادية من قبل HPLC-UV. يخضع وحدة التخزين المتبقية لاستخراج المرحلة الصلبة. لتنفيذ HPLC، أول إلوت عمود C18 تعلق على خرطوشة C18 SecurityGuard مع تدرج من 0.1٪ حمض الفينيك والميثانول.

إعداد برنامج التدرج لتشغيل من صفر إلى 25 دقيقة مع صفر إلى 18٪ الميثانول، من 25 إلى 27 دقيقة مع 18 إلى 0٪ الميثانول، ثم من 27 إلى 37 دقيقة مع 0٪ الميثانول بمعدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة و 30 درجة مئوية. بعد ذلك، حقن حجم بين اثنين وستة ميكرولتردات لكل عينة محفوظة للكمية ديوكسينويوليوسيدات العادية. تعيين كاشف أبي في 260 نانومتر للتكامل من قمم ديوكسيغوانوسين وديوكسيادينوسين.

لأداء استخراج المرحلة الصلبة لتحليل 1، N6-etheno-deoxyadenosine و 1، N2-etheno-deoxyguanosine، تحميل الخراطيش أولا مع سلسلة من الحلول في حجم ملليلتر واحد. إضافة 100٪ الميثانول، والمياه ديون، وعينة الحمض النووي هيدروزيد، والمياه ديوند، 10٪ الميثانول، 15٪ الميثانول، وأخيرا 100٪ الميثانول لجمع. ثم، المضي قدما وفقا للمخطوطة.

بعد إعداد عينات التحلل المائي للحمض النووي 15N5 معيار نظائرية من 8-oxo-deoxyguanosine, نقل 80 ميكرولترات من كل عينة إلى قوارير لتحليلها في نظام HPLC-ESI-MS/MS. حجز 20 ميكرولترات المتبقية من أجل تحديد كمية ديوكسيغوانوسين على HPLC-UV، كما فعلت سابقا. لتحليل 8-oxo-deoxyguanosine على HPLC-ESI-MS/MS، elute العمود C18 A مقرونة بخراطيش الأمن C18 مع التدرج من المذيبات A و B بمعدل تدفق 150 ميكرولترتر في الدقيقة و 25 درجة مئوية.

تشغيل مضخة ثنائي مع صفر إلى 15٪ من المذيبات B خلال أول 25 دقيقة, 15 إلى 80٪ من المذيب B من 25 إلى 28 دقيقة, 80٪ من المذيب B من 28 إلى 31 دقيقة, 80 إلى 0٪ من المذيب B من 31 إلى 33 دقيقة, و 0٪ من المذيب B من 33 إلى 46 دقيقة. مباشرة أول 16 دقيقة من العمود A مُمدد إلى النفايات. العمود الشرط B من مضخة متساوي الراس مع محلول من 15٪ الميثانول في الماء التي تحتوي على 0.1٪ حمض فورميك بمعدل تدفق 150 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة.

بعد ست دقائق، تحقق من الكروماتوغرافية لضمان elutes القياسية 8-oxo-deoxyguanosine من العمود A.خلال الفاصل الزمني 16 إلى 32 دقيقة، والتبديل صمام إلى موقف السماح اتصال بين العمود A والعمود B.إغلاق صمام في 32 دقيقة إلى elute 8-oxo-deoxyguanosine من العمود الثاني والحصول على ذروة حادة الكروموغرافية. لتحليل 1، N6-etheno-deoxyadenosine و 1، N2-etheno-deoxyguanosine، elute عمود C18 مقرونة بخراطيش C18 SecurityGuard مع تدرج من المذيبات A و B بمعدل تدفق 130 ميكرولترز في الدقيقة و 25 درجة مئوية. تشغيل مضخة ثنائية مع 0٪ من المذيب B لأول 10 دقائق، صفر إلى 20٪ من المذيب B لمدة 10 إلى 39 دقيقة، 20 إلى 75٪ من المذيب B من 39 إلى 41 دقيقة، 75٪ من المذيب B من 41 إلى 46 دقيقة، 75 إلى 0٪ من المذيب B من 46 إلى 47 دقيقة، و 0٪ من المذيبات من 47 إلى 60 دقيقة.

استخدم صمام التبديل لتوجيه أول 35 دقيقة من الرمز إلى النفايات وكسر 35 إلى 42 دقيقة إلى مصدر ESI. تأكد من أن معايير adduct من العمود في الفاصل الزمني المحدد. دمج قمم 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 النظائرية القياسية من 8-oxo-deoxyguanosine، 1، N6-etheno-deoxydenosine، 15N5 معيار النظائرية من 1، N6-etheno-deoxyadenosine، 1، N2-etheno-deoxyguanosine، و 15N5 النظائرية القياسية من 1، N2-etheno-deoxyguanosine من تحليلات HPLC-ESI-MS/MS.

حساب نسب المساحة لمناحن المعايرة والعينات. إنشاء منحنيات المعايرة، وحساب كميات الآفات في كل عينة حقن. دمج قمم ديوكسيغونوسين وديوكسيادينوسين من تحليلات HPLC-UV.

استخدام المناطق لإنشاء منحنيات المعايرة، وحساب كميات من ديوكسيغونوسين وديوكسيادينوزين في الحيوانات في كل عينة حقن. حساب الكسور الضروس ل8-oxo-deoxyguanosine على ديوكسيغونوسين، 1، N6-etheno-deoxyadenosine على ديوكسيادينوسين، و 1، N2-etheno-deoxyguanosine على ديوكسيغونوسين، والتي تعطي عدد الآفات لكل مليون ديوكسيغونوسين العادي أو deoxyadenine. يُظهر كروماتوغرام تمثيلي للحمض النووي المنقى الذي تم الحصول عليه من HPLC-UV وجود أربعة ديوكسينويوليسيدات طبيعية، خالية من ريبونوكليوسيدات الحمض النووي الريبي الريبي الريبي، مما يدل على نقاء الحمض النووي.

تظهر الكروماتوغرام التمثيلية من HPLC-ESI-MS/MS من 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, و 1, N2-etheno-deoxyguanosine في عينات الحمض النووي للأنسجة الفئران. الكروماتوغرام التي تم الحصول عليها مع الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية يظهر أربعة ديوكسينويوليوسيدات العادية يائل من العمود الأول حتى حوالي 10 دقيقة، مع فصل جيد من 8-أوكسو-deoxyguanosine، والقضاء على التداخلات غير المرغوب فيها. شيء مهم أن نتذكر لكمية دقيقة هو أن يكون دائما نفس الكميات من المعايير الداخلية في حجم الحقن في منحنيات المعايرة والعينات.

ويمكن تكييف الأساليب المعروضة هنا لأغراض القياس الكمي للنويدات الأخرى المعدلة. توسيع نطاق ديوكسينويوليسيدات المعدلة يسمح بفهم أفضل للآليات الفسيولوجية المرضية الكامنة. يمكننا التحقيق في دور الضرر التأسدي في حالات مختلفة مثل التعرض لxenobiotics ، والسكري ، والتحول الخبيث الخلية ، وبالتالي المساعدة على تطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية.