تطوير استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة من قبل الطفرات ميثانسولفونات إيثيل

ويفصّل هذا البروتوكول تطور مجموعات حراثة قوية ذات ترددات طفرات عالية عن طريق التطفّل المُتَمَرَسّيّة في محاصيل الحبوب الصغيرة. ويمكن استخدام مجموعات حراثة في علم الجينوم الوظيفي، وكذلك لاكتشاف جينات الفضاء الجينية في محاصيل الحبوب الصغيرة. السكان الحرث المتقدمة باستخدام هذه التقنية لديها ترددات الطفرة العالية، ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي نوع جيني.

يمكن إجراء الكشف عن الطفرات القائمة على Cel-1 باستخدام معدات المختبر الأساسية. الخطوة الأكثر أهمية هي تحديد التركيز الأمثل EMS. ولذلك, ينبغي إجراء منحنى جرعة EMS خصيصا للسكان الفردية.

للبدء، نقع 100 البذور مع النمط الجيني من الاهتمام في كل من 250 250 ملليلتر قارورة الزجاج، التي تحتوي على 50 ملليلتر من الماء المقطر. يهز في 100 دورة في الدقيقة لمدة ثماني ساعات في درجة حرارة الغرفة لibmbibition. ثم, في غطاء الدخان, إعداد 50 ملليلتر من حلول EMS من خمسة تركيزات مختلفة عن طريق خلط السائل EMS والمياه المقطرة.

بعد التذمر، اُخرج الماء من خمس قارورات. إضافة 50 ملليلتر من حل EMS في كل من القارورة الخمسة التي تحتوي على البذور الممدودة. هز القارورة لمدة 16 ساعة عند 75 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة.

الآن، decant حل EMS في زجاجة نفايات فارغة وصب البذور المعالجة على قماش الجبن وضعت على زجاجة نفايات فارغة لجمع بشكل منفصل لكل معالجة. استخدام المياه الزائدة للمساعدة في صب البذور. أيضا، رش عدة ملليلترات من محلول EMS المعطل على جدار القارورة الملوثة.

وتزج نصائح الماصات المستخدمة في الحل لمدة 24 ساعة. غير نشط في حل EMS المستخدمة عن طريق إضافة وحدة تخزين واحدة من محلول تعطيل EMS لعلاج لمدة 24 ساعة. باستخدام ربطة عنق تطور، عقد البذور EMS المعالجة داخل قماش الجبن وغسل تحت مياه الصنبور الجارية لمدة ساعتين.

بعد الغسيل، وزرع كل البذور على حدة في المدربين الجذر التي تحتوي على التربة بوتينغ. تنمو النباتات في 20 إلى 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ضوء. بعد 15 يوما من زرع، والتحقق من النباتات، وعدد من البذور التي فشلت في الإنبات.

بيانات تسجيل بقاء النبات. إذا كان معدل البقاء على قيد الحياة ليس ضمن 40 إلى 60٪ إجراء جولة ثانية من تحسين الجرعة مع تركيز معدلة حتى تحقيق معدل الفتك المطلوب من 40 إلى 60٪ بعد تجربة الطفرات، وجمع الأنسجة ورقة من النباتات M2 في 96 جيدا مربع جمع الأنسجة. يتم جمع الأنسجة من النباتات M2 التي كانت تزرع من النباتات M1 الذاتي.

يتم عرض مصنع M2 واحد من كل مصنع M1. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي النباتي مع نظام تنقية الحمض النووي بعد توصيات الشركة المصنعة. ثم، تحميل اثنين microliters من استخراج الحمض النووي في لوحات LV مع 16 فتحات.

كمي الحمض النووي باستخدام مقياس طيفي عند أطوال موجية من 260 و 280 نانومتر. تخفيف تركيز الحمض النووي إلى 25 نانوغرام لكل ميكرولتر مع المياه الخالية من النوى. إنشاء أربع مرات برك الحمض النووي من 200 ميكرولترات من خلال الجمع بين الحمض النووي من كل بئر في أربع كتل بئر 96 في لوحة تجمع مع الحفاظ على هوية الصف والعمود من كل عينة.

بعد ذلك، قم بإعداد أنبوب خلط رئيسي لـ PCR لـ التمهيديات الخاصة بالجينات عن طريق إضافة إلى كل مخزن مؤقت PCR في الأنبوب، والتمهيدي الأمامي والعكوس، وبوليمرات الحمض النووي وفقًا للمخطوطة. Aliquot مزيج سيد في آبار 96 جيدا لوحة PCR. ثم، إضافة قالب الحمض النووي تجمع.

قم بتحميل أنابيب PCR في دورة حرارية، واستخدم ملف تعريف هبوط لتشغيل تفاعل PCR على الدورة الحرارية. لتوليد heteroduplexes بين DNAs غير متطابقة، احتضان منتجات PCR في دورة الحرارية في برنامج مختلف. ثم، إضافة 2.5 ميكرولتررس من endonuclease Cel-1 محلية الصنع إلى كل من المنتجات PCR غير المتغايرة.

احتضان لمدة 45 دقيقة في 45 درجة مئوية. بعد ذلك، إنهاء رد فعل Cel-1 بإضافة 2.5 ميكرولترات من 0.5 EDTA المول في ثماني درجة ا.ف. تحميل 30.5 ميكرولترات من كل منتج علاج Cel-1 مختلطة مع خمسة microliters من صبغ على جل agarose 3 ٪ وتشغيلها في 100 فولت لمدة ساعتين ونصف.

لdevolonvolute برك متحولة، وتحديد zygosity من المسوخ عن طريق تشغيل اثنين من ردود الفعل PCR للحمض النووي M2 الفردية التي يحتوي التفاعل الأول 2.5 ميكرولترات من الحمض النووي M2 و 2.5 ميكرولترات من الحمض النووي من النوع البرية والتفاعل الثاني يحتوي فقط على خمسة ميكرولترات من الحمض النووي M2. ويبين هذا البروتوكول أن التبّح النظم البيئية هي التي تُعدّ من محاصيل الحبوب الصغيرة وتوصيف المُتحولين. منحنى الجرعة يشير إلى جرعات EMS الأمثل لمعدلات البقاء على قيد الحياة 50٪ المطلوبة لثلاثة أنواع مختلفة من القمح.

إن وجود أنماط ظاهرية يمكن التعرف عليها بسهولة في السكان M2 يؤكد فعالية الطفرات في مجموعات الحبوب الصغيرة. وفيما يلي أربعة أمثلة على الأنماط الظاهرية المتحولة في مجموعات M2 تهيّف، متحولة المهق في مجموعة الشعير M2، متحولة كلوريد في سكان الشعير M2، متحولة مُتبدّرة مع تلون وردي في مجموعة Aegilops tauschii M2، ومتحول منخفض الحرث في مجموعة من المكورات التكرومية ثلاثية اللوكتوماتية M2. يُظهر تحديد متحول باستخدام Cel-1 على منصات هلام agarose بركة متحولة محتملة تم تحديدها من أصل 12 تجمعًا متحولًا بواسطة نطاقات مشقوقة فريدة.

وحدد إلغاء الفبركات المتحولة zygosity الطفرة وساعد على تتبع الطفرة وصولا الى عينات فردية. وكان تجمع A4 طفرات غير متغايرة، المشار إليها من قبل العصابات مشقوق في كل من الإطار 4 ومربع 4 عينات الحمض النووي من النوع البري. احتوى تجمع H5 على طفرات هُموزيغوس لأن النطاقات المشقوقة الفريدة كانت موجودة فقط في عينة الحمض النووي من النوع البري في المربع 5 H5.

الخطوة الأكثر أهمية هي تحديد التركيز الأمثل من EMS لتحقيق معدل 40 إلى 60٪ من الفتك. مرة واحدة في مجال حراثة السكان مع ارتفاع تردد الطفرة وقد تم تطويرها يمكن استخدامها في توصيف وظيفي لأي جين من الاهتمام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون السكان مصدراً للتباين الوراثي المفيد لتحسين المحاصيل.

وقد استخدمت الحرث على نطاق واسع لإجراء دراسات الجينوم الوظيفية في النباتات النموذجية والمحاصيل. يمكن أن تكون مجموعة الطفرات التي تم الحصول عليها من الأخطاء أو الضربات القاضية أو أشكال الصمت أو حتى أشكال الأخطاء. EMS هو مطفرة.

لذلك، استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء التعامل مع EMS. إزالة التلوث بقايا الحلول وتستخدم نصائح الماصات.