جيل من الورم الليفي الفا Synuclein المكونة مسبقا من مونومرات واستخدامها في فيفو

يتم استخدام نموذج ألفا سينوكلين Preformed فيبريل من قبل مختبرات في جميع أنحاء العالم لدراسة synucleinopathies. على الرغم من أن النموذج قد استخدمت بنجاح من قبل العديد من المختبرات، شهدت بعض المجموعات التناقضات توليد الفيبريلس وإنتاج متسقة ألفا-سينوكلين علم الأمراض. نأمل أن هذا البروتوكول، الذي يفصل جيل الفيبريلس من مونومرات ألفا سينوكلين واستخدام الفيبريات شكلت مسبقا في الجسم الحي، يمكن الإجابة على الأسئلة التي لدى الباحثين حول استخدام النموذج.

يقوم نموذج الفيبري المشبّل من طراز ألفا-سينوكلين بتلخيص الملامح الرئيسية لمرض باركنسون، مثل أمراض ألفا سينوكلين والتنكس العصبي. وقد تبين أنه يؤدي إلى ضعفات حركية متواضعة في بعض النماذج الحيوانية. تشكيل الادراج التي تحتوي على الفوسفور ألفا سينوكلين وإطالة الوقت دورة نحو التنكس العصبي يقدم للباحثين مراحل مختلفة في جميع مراحل تطور اعتلال synucleino، لدراسة واستهداف للتدخلات العلاجية المحتملة.

مما يدل على إعداد الإبر الزجاج المخصص، هو فني مختبر لدينا، كريستوفر كيمب. لبدء هذا الإجراء، ذوبان أحادية ألفا سينوكلين على الجليد. إعادة تعليق مونومرات المذابة عن طريق الخفقان بلطف على الأنبوب.

وطاردة مركزية عند 15000 غرام و أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ثم، نقل فائقة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 مل نظيفة وتسجيل الكمية المنقولة. تخفيف مونومرات مع 1x dPBS إلى تركيز نهائي من 5 ملغ لكل مل.

دوامة لفترة وجيزة لخلط، وطاردة مركزية لفترة وجيزة لجمع كل من السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك، استخدم فيلم لاصق لتأمين غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلق. ضع الأنبوب في خلاط حراري مداري مع غطاء لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة.

في نهاية سبعة أيام ، يجب أن تظهر محتويات الأنبوب عكرًا. أولاً، دون جميع معدات الحماية الشخصية اللازمة بما في ذلك القفازات، ومعطف مختبر، ودرع الوجه. ثم، في غطاء لثقافة الخلية، نعلق على مسبار قطره 3.2 ملم إلى المحول.

تعيين sonicators السعة إلى 30 ٪ والنبض إلى ثانية واحدة على وأخرى قبالة والوقت إلى دقيقة واحدة. ذوبان في fibrils في درجة حرارة الغرفة، وبينما لا يزال في غطاء محرك السيارة الثقافة، وتمييع فيبريلس مع dPBS العقيمة. المقبل، وتخميد الأنسجة المختبرية مع 70٪ الإيثانول واستخدام هذا لمسح التحقيق من sonicator لتنظيفه.

غمر طرف المسبار في الماء المزدوج والنبض 10 مرات لتنظيف المسبار أكثر. بعد هذا، مسح مسبار الجافة مع نسيج المختبر. ضع طرف المسبار النظيف في أنبوب الفيبريلات المخففة ووضع الطرف في الجزء السفلي من الأنبوب.

سونيكات في fibrils المخفف باستخدام المعلمات التي سبق تعيينها أثناء تحريك المسبار صعودا وهبوطا خلال كل نبضة لضمان أن جميع من fibrils في السائل هي sonicated. بعد سونيكيشن، لفترة وجيزة الطرد المركزي لثانية واحدة في 2، 000 غرام لجمع كل السائل من الجانبين من الأنبوب. غمر طرف المسبار في 1٪ من SDS والنبض 10 مرات لتنظيف المسبار.

ثم، إزالة طرف من SDS، وغمره في الماء المقطر مزدوجة، والنبض 10 مرات. امسح المسبار بأنسجة معملية مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحه جافاً مع نسيج مختبر جاف. فصل التحقيق من المحول والمخزن.

بعد هذا، مسح أسفل جميع الأسطح في غطاء محرك السيارة مع 1٪ SDS تليها 70٪ الإيثانول. للبدء، ضع أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجية السيليكونية في سحب إبرة زجاجية. بدوره على عنصر التدفئة، والسماح للأوزان المرفقة لتمتد أنبوب الشعرية الزجاجية ساخنة.

بعد ذلك ، استخدم المقص لقطع أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة عند أنحف نقطة في الوسط وإزالة الإبرة الزجاجية من سحب الإبرة الزجاجية. ثم، استخدام مقص لقطع طول أنبوب التفاف تقليص إلى حوالي 40 ملم. حرك التفاف يتقلص على إبرة معدنية من حقنة 10 ميكروليتر مشطوف.

استخدام لهب مفتوح لتسخين والتمسك التفاف يتقلص إلى الإبرة، مع التأكد من تدوير الإبرة لتطبيق الحرارة بالتساوي. حرك الطرف الأكبر من إبرة الزجاج المسحوبة بعناية فوق الإبرة المعدنية للحقنة. بعد هذا، وقطع طول أنبوب التفاف يتقلص إلى ما يقرب من 40 ملم وشريحة بعناية على إبرة الزجاج لتداخل قاعدة إبرة الزجاج والإبرة المعدنية من حقنة.

استخدام لهب مفتوح لتسخين لفة يتقلص لتأمين إبرة الزجاج إلى إبرة معدنية. لمزيد من تأمين الإبرة ومنع التسريبات المحتملة، وقطع طول إضافي من أنابيب التفاف يتقلص إلى ما يقرب من 40 ملم، وشريحة بعناية على إبرة الزجاج لتداخل قاعدة إبرة الزجاج والإبرة المعدنية من الحقنة. استخدام لهب مفتوح لتسخين لفة يتقلص لتأمين إبرة الزجاج إلى إبرة معدنية.

ثم، استخدم المقص لتقليم إبرة الزجاج بحيث يكون الطرف حوالي 8 مم طويلة. لاختبار الإبرة، تعبئة حقنة 1 مل مع إبرة قياس 26 المرفقة مع الماء المقطر. إزالة المكبس المعدنية من حقنة إبرة الزجاج المخصصة وإدراج إبرة حقنة مملوءة بالماء في قاعدة الحقنة المخصصة.

فحص واجهة إبرة الزجاج والإبرة المعدنية للتسربات وللتأكد من تدفق المياه بشكل ثابت. ثم املأ أنبوب جهاز طرد مركزي صغير بالماء المقطر. استخدام حقنة إبرة الزجاج المخصصة لرسم في الماء المقطر.

فحص الإبرة للتأكد من أخذ السائل في الحقنة وأنه لا توجد فقاعات. إذا كانت هناك فقاعات، أو إذا لم يتم رسم الماء في الإبرة، يمكن أن يساعد تقليم الإبرة في تخفيف الضغط. بعد ذلك، قم بتخزين الحقنة بعناية مع الإبر الزجاجية المرفقة، في صناديق الحقنة حتى الحاجة إلى العمليات الجراحية.

الفحص مع المجهر الإلكترون انتقال يؤكد وجود fibrils طويلة. وبالمقارنة، فإن مونومرات ألفا-سينوكلين هي الشعير المرئي وليس لها شكل ملحوظ. ثم يتم تأكيد analoid من fibrils باستخدام ثيوفلافيين T Assay.

يظهر مقايسة تمثيلية dPBS والمونومات الماوس تنتج إشارة أقل في وحدات دقيق نسبية مقارنة بففس الماوس. بينما PFFs الإنسان وبالمثل تنتج إشارة أعلى من مونومرات.

إلى القنين وجود فيبريلات قابلة للقذف ، يتم إجراء مقايسة الترسيب. في كل من الماوس وعينات PFF الإنسان، وينبغي أن يكون أكثر من البروتين في بيليه من فوق. في المقابل، فإن غالبية البروتين من الماوس والمونومات البشرية موجودة في عظمى مع وجود القليل في بيليه.

كل من الماوس وPFFs الإنسان هي سونيكاتيد لإنتاج PFFs من أطوال مناسبة لبذاءات ألفا synuclein إدراج. ويكشف فحص شامل لحوالي 500 فيبريلس أن متوسط طول الفيبرات الماوس هو ما يقرب من 44 نانومتر. مع 86.6٪ من PFFs قياس 60 نانومتر أو أقل.

ومع ذلك، يبلغ متوسط طول PFFs البشري حوالي 55.9 نانومتر مع 69.6٪ من PFFs قياس 60 نانومتر أو أقل. في فحص vivo فعالية PFF وأكد باستخدام الكيمياء المناعية. إدراج تشكلت في النيجرا substantia، حصة خصائص مماثلة للأجسام ليوي في أنها تحتوي على synuclein ألفا الفوسفورية، تحتوي على هياكل أمينلوييد، وصمة عار مع ثيوفلافين S، ومقاومة للهضم البروتينات K.

Sonication يمكن أن يعرض sonicating الفردية إلى الفيبريلز المتشكلة الهباء الجوي. على هذا النحو، يجب ارتداء ملابس السلامة المناسبة وينبغي تنفيذ سونيكيشن في غطاء محرك السيارة لتقليل خطر التعرض.