النسخ بدء تعيين الموقع باستخدام فائقة منخفضة الإدخال الناقل-CAGE

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تنظيم الجينات ، لأنها تمكن المروج الأساسي واكتشاف محسن باستخدام كميات منخفضة من المواد الأولية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح غير متحيزة، الجينوم على نطاق واحد مسح النيوكليوتيد القرار من RNA بوليمراسي الثاني مواقع بدء النسخ باستخدام 10 نانوغرام فقط من مجموع الحمض النووي الريبي. كيج يثبت أن لا تقدر بثمن للكشف عن مواقع بدء النسخ المرتبطة بالمرض التي يمكن استخدامها كعلامات التشخيص.

SLIC-CAGE يمتد هذه الاكتشافات إلى عينات النطاق مثل خزعات الأنسجة. SLIC-CAGE هو مناسب بشكل مثالي لتحليل المروج المتعمق وعالي الدقة لأنواع الخلايا الضعيفة، بما في ذلك مراحل النمو الجنينية المبكرة أو الأنسجة الجنينية من مجموعة واسعة من الكائنات العضوية النموذجية. منذ هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان للحد من فقدان العينة في كل خطوة عن طريق الحرص على استرداد أكبر قدر ممكن من المواد عند نقل بين الأنابيب.

ابدأ بإعداد مزيج PCR لكل قالب. الجمع بين العازلة، dNTPs، التمهيدي إلى الأمام فريدة من نوعها، قالب بلاسميد مع الجين الناقل الاصطناعية، وبوليميراز الانصهار وفقا لاتجاهات المخطوطات. خلط الكواشف عن طريق الأنابيب.

إضافة 90 ميكرولترات من مزيج PCR إلى 10 ميكرولترات من كل التمهيدي العكسي ومزيج. راجع المخطوطة لمعرفة ظروف الدراجات الحرارية. تنفيذ النسخ العكسي أو RT على الجيش الملكي النيبالي من الفائدة.

الجمع بين ميكرولتر واحد من النسخ العكسي التمهيدي، 10 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، و 4، 990 نانوغرام من مزيج الناقل في حجم إجمالي من 10 ميكرولترات. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. سخني الخليط إلى 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم وضعه على الجليد على الفور.

إعداد مزيج RT وفقا لاتجاهات المخطوطة وإضافة 28 ميكرولترات من هذا المزيج إلى 10 ميكرولترات من RNA. خلط محتويات الأنبوب عن طريق الأنابيب حتى تجانس. تشغيل RT في ثيركلوفير.

بمجرد اكتمال النسخ العكسي ، قم بتنقية المنتج باستخدام حبات SPRI المغناطيسية الخالية من RNase و RNase. إضافة الخرز إلى مزيج RT في نسبة حجم 1.8 إلى واحد ويخلط جيدا عن طريق الأنابيب. دع الخليط يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم، ضع الخرز على حامل مغناطيسي واتركه منفصلاً لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير وأضف 200 ميكرولترات من الإيثانول الطازجة المعدة بنسبة 70٪إلى الخرز. لا تخلط الخرز أو تأخذها من موقف مغناطيسي وإزالة الإيثانول مباشرة بعد إضافة.

الحفاظ على أنبوب على موقف المغناطيسي وإزالة جميع آثار الإيثانول عن طريق دفع أي قطرات المتبقية مع ماصة P10. إضافة فوري 42 ميكرولترات من الماء، وماصات صعودا وهبوطا 60 مرة إلى عينة مائل، مع الحرص على عدم التسبب في رغوة. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق دون غطاء ومن ثم فصل الخرز على المنصة المغناطيسية.

ثم، نقل افرانت إلى مجموعة جديدة من الأنابيب، مع الحرص على استرداد جميع فائق ولكن تجنب حمل حبة. بعد العلاج RNase الأول، مزيج 45 ميكرولترات من العينة مع 105 ميكرولترات من الخرز streptavidin أعدت واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال الحضانة، ماصة العينة كل 10 دقيقة لخلط.

ثم، فصل الخرز على الحامل المغناطيسي وإزالة افرا. غسل الخرز مع المخازن المؤقتة A، B، وC.البدء مع العازلة A، resuspend الخرز في 150 ميكرولترات من العازلة. فصل على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، ثم إزالة ناظر.

سخني العازلين B و C إلى 37 درجة مئوية وكرر خطوات الغسيل. لإزالة جميع الحمض النووي الريبي غير المغطاة، فمن الأهمية بمكان لغسل الخرز streptavidin والجدران أنبوب بدقة وإزالة تماما العازلة غسل قبل إضافة واحد المقبل. لإطلاق سراح cDNA، resuspend الخرز في 35 ميكرولترات من 1X RNase I العازلة واحتضان في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد الحضانة، ضع على الفور الخرز على الجليد لمدة دقيقتين. فصل الخرز على موقف مغناطيسي ونقل ناظر إلى مجموعة جديدة من الأنابيب. Resuspend الخرز في 30 ميكرولترات من 1X RNase أنا العازلة ومن ثم منفصلة على موقف مغناطيسي.

الجمع بين المابير مع ناظر التي تم جمعها سابقا لحجم إجمالي يبلغ حوالي 65 ميكرولترات. تنفيذ qPCR لتحديد عدد دورات PCR لتضخيم المكتبة المستهدفة. إعداد خلطات سيد qPCR لتضخيم مكتبات كاملة من الحمض النووي من الناقل.

تعيين ظروف الدراجات الحرارية وفقا لاتجاهات المخطوطات وتضخيم العينة المعدة. بروتوكول SLIC-CAGE يجعل من الممكن الحصول على المكتبات الجاهزة التسلسل من نانوجرامات من المواد RNA بدء. يتراوح طول الجزء في المكتبة النهائية بين 200 و2,000 زوج أساسي.

شظايا أقصر هي القطع الأثرية PCR ويمكن أن يسبب مشاكل التسلسل أسفل الخط. يمكن إجراء جولات إضافية من تحديد الحجم لإزالتها. بالمقارنة مع NanoCAGE ، SLIC-CAGE معارض أفضل بكثير الأداء في النسخ بدء تحديد الموقع ، وهو واضح من منحنيات التشغيل المتلقي من التقنيات اثنين من تنفيذها على كميات مختلفة من S.cerevisiae مجموع RNA.

أثناء تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن فقدان العينة قد يؤدي إلى مكتبات منخفضة التعقيد. لمنع ذلك، يجب استخدام نصائح الأنابيب والميصة المنخفضة الملزمة. دون SLIC-CAGE، لم يكن من المتعذر الوصول إلى تحليل المروج لأنواع مختلفة من الخلايا حتى الآن.

ويشمل ذلك تحليل مراحل النمو الجنينية أو الأنسجة الجنينية من مجموعة واسعة من الكائنات العضوية النموذجية.