Name: فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: استكشف تحليل نشاط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي بدون أجسام مضادة باستخدام S-adenosyl-methionine المشع. هذه الطريقة الحساسة تتيح القياس الكمي والتصور النوعي للمثيلة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور تورجا كانتي ديبناث على مساعدته في شركة ChemDraw. ويدعم البحوث في مختبر Xhemalçe من قبل وزارة الدفاع - برنامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس - جائزة اختراق سرطان الثدي (W81XWH-16-1-0352)، NIH منحة R01 GM127802 والأموال الناشئة من معهد الخلوية والخلوية البيولوجيا الجزيئية وكلية العلوم الطبيعية في جامعة تكساس في أوستن، الولايات المتحدة الأمريكية.

<ol><li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+histones+to+RNA%3A+role+of+methylation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+Watches+the+Watchmen%3A+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).</li>
<li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+methylation+of+m%286%29Am+in+the+5%27+cap+controls+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U6+snRNA+m%286%29A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+UTR+m%286%29A+Promotes+Cap-Independent+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li>
<li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li>
<li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li>
<li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).</li>
<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

هنا، يتم الإبلاغ عن طريقة بسيطة وقوية للتحقق في المختبر من نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز نحو نسخ محددة. ويستفيد الفحص من حقيقة أن الميثيونين S-adenosyl يمكن أن يكون tritiated على المانحة مجموعة الميثيل (الشكل1)،مما يسمح لRNA ميثيلات إلى الكشف بدقة دون استخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن هذا التقييم لا يمكن أن تشير إلى أي بقايا أو مجموعة كيميائية هو ميثيلات من قبل الإنزيم. ولتحديد أو التحقق من أن بقايا معينة قد طُرِّمت، يمكن استخدام أساليب أخرى مثل تحليل الطفرات...

الحمض النووي، الحمض النووي الريبي والبروتينات تخضع للتعديلات التي تنظم بإحكام التعبير الجيني1. ومن بين هذه التعديلات، تحدث المثيلة على جميع البوليمرات الحيوية الثلاثة. وقد تم دراسة الحمض النووي والبروتين الميثيل بشكل جيد جدا خلال العقود الثلاثة الماضية. وعلى النقيض من ذلك، لم يتجدد الاهتمام بمثيلة الحمض النووي الريبي إلا مؤخراً في ضوءالأدوار الهامة التي تلعبها البروتينات التي تكتب أو تمحو أو تربط المثيلة في التنمية والمرض 2. بالإضافة إلى وظائف معروفة في ribosomal وفيرة ونقل RNAs، مسارات مثيلة RNA تنظيم محددة رسول RNA الاستقرار3،4، الربط5 والترجمة6،7، ميرنامعالجة 8،9 والتوقف النسخي والإفراج 10،11.
هنا، يتم الإبلاغ عن طريقة بسيطة وقوية للتحقق في المختبر من نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز في إعداد مختبر البيولوجيا الجزيئية (ملخصة في الشكل1). كثير دراسات يقيّم النشاط من [رنا] [مثلترانسفيرس] كلّيّا [دوت-بلووت] مع جسم مضادّ ضدّ ال [رنا] تعديل الفائدة. ومع ذلك، لا تحقق نقطة وصمة عار من سلامة الحمض النووي الريبي عند الحضانة مع الحمض النووي الريبي methyltransferase. وهذا أمر مهم لأنه حتى التلوث الطفيف للبروتينات المؤتلفة مع النوكلورات يمكن أن يؤدي إلى تدهور جزئي للRNA ونتائج مربكة. وعلاوة على ذلك، حتى الأجسام المضادة تعديل RNA محددة للغاية يمكن التعرف على RNAs غير معدلة مع تسلسلات محددة أو هياكل. في المختبر الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز الفحص ذكرت هنا يستفيد من حقيقة أن الميثيونين S-adenosyl يمكن أن تكون tritiated على المانحة مجموعة الميثيل (الشكل1)،مما يسمح لRNA ميثيلات إلى الكشف بدقة دون استخدام الأجسام المضادة . يتم توفير التعليمات للنسخ في المختبر وتنقية نسخة من الاهتمام واختبار مثيلة من النص المذكور من قبل إنزيم الفائدة. هذه الطريقة مرنة وقوية، ويمكن تعديلها وفقا لاحتياجات أي مشروع معين. على سبيل المثال، في المختبر منقولة ونقية RNAs، توليفها كيميائيا RNAs، ولكن أيضا RNAs الخلوية يمكن استخدامها. يوفر هذا التحليل معلومات كمية في شكل حساب التلألؤ، فضلا عن المعلومات النوعية من خلال إظهار المكان الذي يعمل فيه الحمض النووي الريبي المثيلي على هلام. وهذا يمكن أن يوفر رؤية فريدة من نوعها في وظيفة ميثيل ترانسفيراز RNA، لا سيما عند استخدام RNAs الخلوية كالركيزة، كما أنه يوفر طريقة لمراقبة مباشرة حجم RNA أو RNAs التي تستهدف الميثيل.

<table><tbody><tr><td>10 نقطة أساس سلم الحمض النووي</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>10 نقطة أساس DNA سلم كيت.</td></tr><tr><td>10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS) &nbsp ؛</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>لجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا (ل 10 مل ، قم بإذابة 1 جم في 8 مل من ماء مللي كيو ؛ اضبط الحجم على 10 مل بماء مللي كيو ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام حقنة 10 مل مجهزة ب 0.45 & micro ؛ مرشح م).</td></tr><tr><td>10X TBE Buffer</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>لجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا (لمدة 1 لتر ، أضف 108 جم من Tris Base ، و 55 جم من حمض البوريك إلى أسطوانة مع شريط تحريك ؛ أضف 800 مل من الماء المقطر واتركه يذوب ؛ أضف 40 مل من 0.5 M Na2EDTA (درجة الحموضة 8.0) ؛ اضبط الحجم إلى 1 لتر بماء milliQ ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام 0.22 & micro ؛ مرشح م).</td></tr><tr><td>10 × تيرابايت</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>للحصول على 1 لتر ، أضف 60.5 جم من Tris Base ، و 87.6 جم من كلوريد الصوديوم إلى أسطوانة بقضيب تقليب ؛ أضف 800 مل من الماء المقطر واتركها تذوب ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز ؛ اضبط الحجم على 1 لتر بماء milliQ ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام 0.22 & micro ؛ مرشح م.&nbsp;</td></tr><tr><td>أكريلاميد: Bis-Acrylamide 29: 1 (40٪ محلول / الرحلان الكهربائي) ، Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>لتغيير طبيعة اليوريا جل بولي أكريلاميد.</td></tr><tr><td>أدينوسيل-ل-ميثيونين, S- [ميثيل-3H]; (سام [3 ح])</td><td>بيركين إلمر</td><td>NET155V250UC</td><td>لمثيلة الحمض النووي الريبي في المختبر ؛ التركيز = 1.0 ملي Ci / مل ؛ نشاط محدد = 17.1 Ci / mmol ؛ المولارية = (1.0 Ci / L) / (83.2 Ci / mmol) = 0.0584 مليمول / لتر = 58.4 &micro ؛ M. &nbsp ؛ &nbsp; عند استلام أنبوب 3H-SAM المجمد ، قم بإذابة الثلج عند 4 درجات ؛ C ، جعل 20 & micro ؛ L aliquots ، وتجميدها عند -30 درجة مئوية. لا تقم أبدا بإعادة تجميد وإعادة استخدام حصة مستخدمة جزئيا.</td></tr><tr><td>أمرشام هايبر كاسيت التصوير الشعاعي الذاتي كاسيت</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>للتعرض لهلام الأشعة الذاتية.</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td></td> GE <td>Healthcare 28906846</td><td>للتعرض لجل التصويري الذاتي.</td></tr><tr><td>عداد الوميض</td><td>بيكمان</td><td>LS6500</td><td>لعدد التلألؤ السائل.</td></tr><tr><td>نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغير Biorad</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغير.</td></tr><tr><td>أقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الخالية من EDTA</td> من <td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>للحصول على محلول 20X ، قم بإذابة قرص واحد في 0.525 مل من الماء الخالي من النوكلياز.</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>RNase كاسيت فارغ مجاني لهلام بولي أكريلاميد.</td></tr><tr><td>معيار الكاسيت الفارغة</td><td>Biorad</td><td>1656001</td><td>خلية الرحلان الكهربائي العمودي بتنسيق متوسط.</td></tr>مقياس <tr><td>الطيف الضوئي DeNovix DS-11 مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الصغير</td><td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>لقياس تركيز الحمض النووي والحمض النووي الريبي.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>لعدد التلألؤ السائل.</td></tr><tr><td>قوارير فيشربراند 7 مل HDPE تلألؤ</td><td>فيشر</td><td>03-337-1</td><td>لعدد التلألؤ السائل.</td></tr><tr><td>محسن التصوير الشعاعي الذاتي سريع المفعول Fluoro-Hance</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>للمعالجة المسبقة لهلام الأشعة الذاتية.</td></tr><tr><td>جل مجفف</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>لتجفيف الجل.</td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>لتحميل الحمض النووي الريبي في تغيير طبيعة هلام اليوريا بولي أكريلاميد (التركيب: 95٪ فورماميد ، 18 ملي مولار EDTA ، و 0.025٪ SDS ، زيلين سيانول ، وبروموفينول أزرق).</td></tr><tr><td>نصائح استئصال الجل القابل للتصرف GeneCatcher</td><td>شركة Gel</td><td>NC9431993</td><td>لإزالة العصابات من المواد الهلامية الاغاروز والبولي أكريلاميد.</td></tr><tr><td>Megascript Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>للنسخ في المختبر مع T7 RNA polymerase.&nbsp;</td></tr><tr><td>Perfectwestern Extralarge Container</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382 (شفاف) / NC9965364 (أسود)</td> <td>صندوق تلطيخ جل.</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td> <td># 27663</td><td>البلازميد لإنتاج نصوص في المختبر بنهايات متجانسة</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>لتنظيف الحمض النووي الريبي ، استخدم البروتوكول المعدل الوارد في البروتوكول.</td></tr><tr><td>طقم استخراج جل QIAquick (50)</td> <td>مجموعة Qiagen</td><td>28704</td><td>لاستخراج الجل وتنظيف جزء dsDNA المستخدم في النسخ في المختبر.</td></tr><tr><td>ساران بريميوم بلاستيك التفاف</td><td>ساران</td><td>راب أمازون</td><td>لتجفيف الجل.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>صبغة هلام الحمض النووي فائقة الحساسية.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>صبغة هلام الحمض النووي.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 ملي Tris-HCl ، 1 ملي مولار ثنائي الصوديوم EDTA ، درجة الحموضة 8.0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>لتغيير طبيعة اليوريا جل بولي أكريلاميد.</td></tr><tr><td>خلاط حراري مع أنابيب SMARTBLOCK 24X 1.5 مل</td><td>eppendorf</td><td>5382000023 / 5361000038</td><td>لحضانة أنابيب 1.5 مل للتحكم في درجة الحرارة.</td></tr>مجموعات <tr><td>تقنيات</td><td></td> <td>الحياة لمجموعة الاستنساخ TOPO TA</td><td>للاستنساخ السريع ل Taq polymerase & ndash ؛ تضخيم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نواقل تحتوي على محفزات T7 و / أو SP6 لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر.</td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U & frasl ؛ ومايكرو. L)</td> <td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>لإزالة الحمض النووي من تفاعلات النسخ في المختبر.</td></tr><tr><td>اليوريا</td><td>سيجما</td><td>51456-500 جرام</td><td>لجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا.</td></tr><tr><td>ورق Whatman 3MM</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-154</td><td>ورق كروماتوغرافيا لتجفيف الجل.</td></tr></tbody></table>

فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

هناك أكثر من 100 تعديلات متميزة كيميائيا من الحمض النووي الريبي، ثلثيها تتكون من ميثيلات. وقد ظهر الاهتمام بتعديلات الحمض النووي الريبي، وخاصة المثيلية، مرة أخرى بسبب الأدوار الهامة التي تقوم بها الإنزيمات التي تكتب وتمحوها في العمليات البيولوجية ذات الصلة بالمرض والسرطان. هنا، يتم توفير تحليل حساس في المختبر لتحليل دقيق لنشاط كاتب مثيلالحمض النووي الريبي على RNAs الاصطناعية أو في المختبر المنقولة. يستخدم هذا الاختبار شكل ثلاثي الجوانب من S-adenosyl-methionine، مما يؤدي إلى وضع العلامات المباشرة على الحمض النووي الريبي الميثيلي مع التريتيوم. الطاقة المنخفضة من إشعاع التريتيوم يجعل الأسلوب آمن، والأساليب الموجودة من قبل من تضخيم إشارة التريتيوم، تجعل من الممكن لتحديد وتصور الحمض النووي الريبي الميثيلي دون استخدام الأجسام المضادة، والتي هي عادة عرضة للقطع الأثرية. في حين أن هذه الطريقة مكتوبة لمثيلة الحمض النووي الريبي، عدد قليل من القرص جعله ينطبق على دراسة التعديلات الحمض النووي الريبي الأخرى التي يمكن وصفها إشعاعيا، مثل أسيتيل الحمض النووي الريبي مع 14C أسيتيل الإنزيم A. عموما، وهذا الفحص يسمح لتقييم بسرعة RNA شروط المثيلة، تثبيط مع مثبطات جزيء صغير، أو تأثير RNA أو متحولة الإنزيم، ويوفر أداة قوية للتحقق من صحة وتوسيع النتائج التي تم الحصول عليها في الخلايا.

رد فعل النسخ في المختبر الشكل 2 يمثّل [ا] شوط نموذجيّة من [إينترو فيترو] نسخ ردّ فعل مع ال [ت7] [رنا] [بولمرس] من ال [7سك] [سنرنا], أيّ يكون نسبيّا قصيرة (331 [نت]) وجدّا ينظّم [رنا]. كما هو مبين في تلك الصورة الخام، هناك العديد من العصابات غير المرغوب فيها، على حد سواء أقصر وأطول من 7SK، وربما الناجمة عن بدء النسخ العشوائي أو أحداث الإنهاء. وبسبب هذا، تنقية هلام بعد رد فعل النسخ في المختبر من المهم الحصول على عينة RNA نظيفة كما هو مبين في <strong class=...

هنا، يتم وصف فحص الأجسام المضادة الخالية في المختبر للتحليل المباشر لنشاط ميثيل ترانسفيراز على الحمض النووي الريبي الاصطناعية أو في المختبر.

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

هناك أكثر من 100 تعديل متميز للرنا، ثلثاها ميثيلات. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحليل حساس ودقيق لنشاط كاتب الميثيل RNA. هذه التقنية سهلة الاستخدام تسمح لنا بتحديد وقياس الحمض النووي الريبي الميثيلي دون استخدام الأجسام المضادة، التي عادة ما تكون عرضة للتحف.(إنّها ستُظهر الإجراء ستكون (سامانثا شيلتون طالبة خرّج من مختبري لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد مقايسة RNA ميثيلtransferase ذات 100 ميكرولتر في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد، كما هو مبين في بروتوكول النص. دوامة أنبوب لخلط دقيق، والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس ثوان لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم، قم بتنظيف التفاعل باستخدام تنقية العمود، كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء عدد التلألؤ السائل، قم بإعداد رف العد المتألق مع قارورة واحدة لكل عينة، وقارورة واحدة لقياس الخلفية، وقارورة واحدة لاختبار السحب.ملء قوارير مع خمسة ملليلتر من التلألؤ عد الحل. إضافة 10 ميكرولترات من كل عينة الحمض النووي الريبي المشعة في قارورة واحدة. شد الغطاء، واخلطه بلطف.لتحضير قارورة الاختبار، فرك مسحات القطن بدقة على جميع الأسطح والمعدات المستخدمة أثناء الإجراء. إضافة هذه المسحات إلى قوارير مليئة حل التلألؤ، وتشديد الغطاء. لتشغيل العينات على عداد التلألؤ، افتح غطاء مضادة، أدخل الحامل في الجهاز، واغلق غطاء المحرك.حدد عد حامل مفرد. اختر تحديد برنامج المستخدم. حدد أو أنشئ برنامجًا يقيس التريتيوم لمدة 60 ثانية، واضرب رف العد.كرر العد التلألؤ ثلاث مرات. بعد ذلك، أعد وإعادة تشغيل هلام بولي أكريلاميد اليوريا، كما هو مبين في بروتوكول النص. نقل 20 ميكرولترات من مادة الحمض النووي الريبي المشعة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر يحتوي على 20 ميكرولترات من 2X هلام تحميل العازلة.بعد إعداد السلم، احتضان العينات في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل آبار هلام مرة أخرى على الفور قبل تحميل العينة عن طريق الأنابيب العازلة من خزانات هلام إلى أسفل في آبار الجل. ثم، تحميل 20 ميكرولترات من سلم المعدة، 20 ميكرولترات من العينات، و 20 ميكرولترات من 1X هلام تحميل العازلة في الممرات من هلام.تشغيل الجل في 100 فولت لمدة 60 إلى 180 دقيقة، اعتمادا على نسبة البولي أكريلاميد. بمجرد الانتهاء من تشغيل الجل ، قم بإزالة الجل من الكاسيت وضعه في صندوق يحتوي على 50 ملليلتر من 1X TBE buffer مع خمسة ميكرولترات من وصمة هلام حمض نووي شديدة الحساسية. احتضان على الروك لمدة خمس دقائق لطخة الجيش الملكي النيبالي.بعد هذا، بعناية تأخذ هلام من منطقة الجزاء، ووضعها على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية من هلام التصوير مع الآبار صعودا وسلم على اليسار. ركّز الكاميرا على الجل، واشعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية، واصطُل صورة للهلام. ثم، إيقاف التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وحفظ الصورة كملف TIFF.وضع هلام مرة أخرى في منطقة الجزاء، وإزالة TBE، وإصلاح هلام مع 50 ملليلتر من حل إصلاح على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحريك الجل بلطف إلى صندوق أسود جديد يحتوي على 25 ملليلتر من محلول تعزيز التصوير التلقائي. احتضان على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.رفع بلطف هلام، ووضعها وجها إلى أسفل على ورقة من البلاستيك التفاف مع الآبار صعودا وسلم على الجانب الأيمن. ضع ورقتين من ورق الكروماتوغرافيا على الجزء الخلفي من الجل، وقلب المكدس بأكمله. قبل تسخين مجفف هلام إلى 80 درجة مئوية.نقل الغطاء البلاستيكي على مجفف هلام مرة أخرى. إدراج المكدس بأكمله تحت الغطاء البلاستيكي، ونقل الغطاء البلاستيكي إلى أسفل لإنشاء ختم. جفف الجل عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.ثم، إيقاف المجفف هلام، وإزالة المكدس بلطف. قم بإزالة ورق اللتفاف وورق اللوني الثاني. الشريط ورقة الكروماتوغرافيا المتبقية مع هلام المجففة في شريط فيديو تلقائي.في غرفة مظلمة، إضافة ورقة واحدة من فيلم التصوير الذاتي. تخزين الكاسيت في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية، وتطوير الفيلم في الوقت المناسب، اعتمادا على كثافة الإشارة. بمجرد تطوير الفيلم، وضعه على رأس الكاسيت واستخدام علامة مختبر لوضع علامة بعناية على أربعة حواف من هلام، كل بئر، وموقف الأصباغ XC وBB.مسح الفيلم بدقة 300 أو 600 بكسل في البوصة، وحفظ الصورة كملف TIFF. في هذه الدراسة، هو واضح فحص خالية من الأجسام المضادة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيلtransferase. وهناك تشغيل نموذجي من رد فعل النسخ في المختبر مع البوليميراز T7 RNA من 7SK الحمض النووي الصغير يظهر الجيش الملكي النيبالي قصيرة نسبيا وعالية الهيكلة.هناك عدة نطاقات غير مرغوب فيها، سواء أقصر أو أطول من 7SK، ربما ينتج عن بدء النسخ أو إنهاء الأحداث العشوائية. وبسبب هذا، تنقية هلام بعد رد فعل النسخ في المختبر المهم للحصول على عينة RNA نظيفة. عند هذه النقطة، يمكن تحديد الجيش الملكي النيبالي من الفائدة من موقعها بالنسبة إلى سلم وتنقيتها تنقية هلام.يظهر هنا تحليل ميثيل ترانسفيراز RNA ممثل باستخدام الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي الموصى به وتركيزات البروتين. هذا الفحص يسمح لكل من النتائج الكمية من التهم التلألؤ، فضلا عن النتائج النوعية من autoradiogram. هنا، يظهر ميثيل RNA ميثيل ترانسفيراز المعروف لميثيلات 7SK لتكون قادرة على ميثيلات U6 أيضا. وعلاوة على ذلك، كما هو مبين مؤخرا ل7SK، ربط هيستون H4 إلى MePCE يمنع أيضا ميثيل U6.ويمكن ملاحظة ذلك في كل من عدد التلألؤ وraradiogram، مما يدل على قوة هذا البروتوكول. رنا عرضة للتدهور، لذا يرجى التأكد من استخدام الكواشف الخالية من RNase وتنظيف جميع الأسطح والمعدات بشكل شامل. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع الذي تم الحصول عليه من مقايسة الميثيل ترانسفيراز هذه مباشرة لتقييم نشاط الحمض النووي الريبي أو نشاط الربط الحمض النووي الريبي بواسطة مقايسة تحول الحركة الكهربائية، على سبيل المثال.هذه الطريقة تسمح للباحثين لاختبار تأثير عوامل مختلفة على نشاط الحمض النووي الريبي ميثيلtransferase، بما في ذلك الطفرات نقطة وعلاجات مثبطات الجزيء الصغيرة. وتستخدم هذه الطريقة مواد مشعة، لذا تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، وأن تكون حذراً أثناء مناولة المواد المشعة والتخلص منها.

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

يصف هذا البروتوكول في إعداد ركيزة الحمض الريبي النووي النقال الاصطناعية...

الفحص في المختبر مثلأيشن الحمض الريبي النووي النقال مع الحمض النووي للنسج المتحولة والحمض الريبي النووي النقال Dnmt2 Methyltransferase (Ehmeth) انزيم

ووصف طريقة النشاف شمال المعدلة لقياس N 6 -methyladenosine (م 6 أ) التعديلات في الحمض النووي الريبي. الطريقة الحالية يمكن الكشف عن تعديلات في الرنا متنوعة والضوابط في إطار مختلف التصاميم التجريبية.

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتوصيف البيوكيميائية إنزيم الرنا--تعديل الخميرة، Mod5، ومناقشة كيف يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الإنزيمات الأخرى تعديل الحمض النووي الريبي.

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

هنا نقدم بروتوكول لشق DNAzyme تعتمد على RNA. وهذا يتيح التحليل السريع والمعتمد على الموقع لRNA 2'-O-methylation. ويمكن استخدام هذا النهج للتقييم الأولي أو الرئيسي لنشاط النورا.

تحليل تعتمد على DNAzyme من rRNA 2'-O-Methylation

ميثيل الحمض النووي الريبي ميثيل المناعة المقايسة هو طريقة تعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة لإثراء لشظايا الحمض النووي الريبي الميثيل. إلى جانب التسلسل العميق ، فإنه يؤدي إلى تحديد النصوص التي تحمل تعديل M5C.

ميثيل الحمض النووي الريبي الفحص المناعي لدراسة m5C التعديل في arabidopsis

توفر هذه البروتوكولات المنهجية المستخدمة لتقييم النشاط الأنزيمي لأفراد عائلة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMT) في الخلايا. يتم وصف إرشادات مفصلة حول تقييم نشاط PRMT باستخدام المؤشرات الحيوية الذاتية والخارجية ، والتعرف على الميثيل أرجينين الأجسام المضادة ، ومركبات أداة المانع.

الأساليب الكمية لدراسة البروتين أرجينين ميثيلترانسفيراز 1-9 النشاط في الخلايا

دور تعديلات الحمض النووي الريبي في العدوى الفيروسية بدأت للتو لاستكشاف ويمكن تسليط الضوء على آليات جديدة للتفاعل الفيروسي المضيف. في هذا العمل، ونحن نقدم خط أنابيب للتحقيق في M6A و M5C التعديلات الحمض النووي الريبي في سياق العدوى الفيروسية.

استكشاف m6A و m5C Epitranscriptomes على العدوى الفيروسية: مثال مع فيروس نقص المناعة البشرية

ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي هي أهداف محتملة لأدوية السرطان. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتقييم الجزيئات الصغيرة لتثبيط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي. يستخدم هذا الفحص نوكلياز داخلي لإقران مثيلة الحمض النووي بتوليد التألق ويسمح بمراقبة نشاط الإنزيم في الوقت الفعلي.

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

هنا، نقدم بروتوكولا لتقييم مستويات m⁶A العالمية بشكل شبه كمي باستخدام نقطة النقطة. يتم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي، وتفكيكه، ونشره على غشية نايلون، وفحص بجسم مضاد مضاد ل m⁶A، ويتم رؤيته بواسطة الإضاءة الكيميائية. تعكس شدة الإشارة، التي تم قياسها بواسطة تحليل ImageJ الرمادي، وفرة المثيلة النسبية، مما يوفر سير عمل قابل للتكرار للبحث.

اختبار نقطة النقطة للكشف عن مستويات تعديل الحمض النووي الريبي العالميN 6-ميثيلادينوزين

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجينة (سبلاش)، والتي تمكن رسم الخرائط على نطاق الجينوم التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات رنا-رنا في الجسم الحي . سبلاش يمكن تطبيقها لدراسة رنا تفاعلات الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والبكتيريا والبشر.

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

استكشف تحليل نشاط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي بدون أجسام مضادة باستخدام S-adenosyl-methionine المشع. هذه الطريقة الحساسة تتيح القياس الكمي والتصور النوعي للمثيلة.

فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز

استكشف المزيد من الفيديوهات