منصة معالجة الخلية المتكاملة مقرونة بمسبار واحد لتحليل قياس الطيف الكتلي للأدوية والأيض في خلايا تعليق واحدة
June 21st, 2019
تم تطوير منصة معالجة خلية متكاملة للاستخدام بالاقتران مع إعداد قياس الطيف الكتلي أحادي التحقيق لتحليل خلايا التعليق الفردية على الخط في الظروف المحيطة.
منذ هذه الطريقة يحلل الخلايا من الحل، فإنه يمكن استخدامها لدراسة الخلايا في بيئة قريبة من الأم. وهذا يشمل تحليل عينات الخلايا المشتقة من المريض. هذه التقنية يتطلب القليل أو لا إعداد عينة من الخلايا.
لذلك، يمكننا تحليل الخلايا الفردية عبر الإنترنت في ظل الظروف المحيطة، مما يسمح لنا باستكشاف التغاير الخلوي. يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة الخزعات السائلة من مجموعة متنوعة من حالات المرض المختلفة ، لأنها يمكن أن تحليل أنواع مختلفة من الخلايا المعزولة مباشرة عن عينات المرضى. لتحويل واحد أنابيب الزجاج تتحمل إلى مسبار مدبب مع طرف حاد، المقام الأول أنبوب زجاجي واحد تتحمل في المشابك من حامل ماصة عمودي، مركزة الزجاج فيما يتعلق لفائف التدفئة وتشديد لتأمين أنبوب في مكان.
وتتألف لفائف التدفئة من 18 قياس النيكل الكروم المقاومة سلك ملفوف حول قضيب معدني 2.5 مرات. تعيين أنابيب الزجاج مع برنامج درجة الحرارة 19.5. تعيين المكبس اللولبي في أربعة.
الزناد اللولبي لسحب أنابيب الزجاج. هذه الخطوة يخلق اثنين من تحقيقات تنصهر في الطرف. استخدام البلوزات لقطع ما يقرب من ملليمتر واحد بعيدا عن غيض من كل مسبار، وخلق فتحة من حوالي 10 ميكرون في القطر في طرف التحقيق.
لثني مسبار الزجاج لالتيا اقتران سهلة إلى ICMP، SCMS التحقيق واحد إعداد. تعيين أول مسبار الزجاج سحبت في microforge. ضع الجزء العلوي حوالي ثلاثة ملليمترات فوق سلك التدفئة البلاتيني.
ثم، تحويل الحرارة على السلك البلاتيني إلى 30٪ من درجة الحرارة القصوى. ثني المسبار حوالي 45 درجة من الوضع الأصلي. ضع المجهر المقلوب في جهازي معالجة الخلايا على طاولة مزودة بمحركات لتسهيل اقترانها مع مطياف الكتلة.
لإعداد جهاز اختيار الخلايا الزجاجية ، أدخل مسبار اختيار الخلايا الزجاجية داخل حامل معدني من المنازن الصغير عن طريق وضع الشريحة الطويلة في حامل الشعيرات الدموية وتشديد المسمار لتأمين التحقيق في مكان. ضع نصائح المسبار بزاوية موازية للصحن المدفأ. تأمين حامل المعادن من الحقن الدقيقة في نظام التلاعب الخلية.
ثم ضع طرف المسبار بالقرب من منتصف ضوء المجهر المقلوب. تأمين الشريحة الزجاجية التي تحتوي على مسبار واحد في المشبك الذراع من نظام التلاعب الخلية. ربط المذيب توفير الشعرية إلى الاتحاد موصل عن طريق وضع الشعرية في كم من الضراوة البلاستيكية والاصبع تشديد المناسب.
ربط الجانب الآخر من الاتحاد موصل إلى الشعرية التي ترتبط بحقنة تحتوي على المذيبات أخذ العينات عن طريق وضع الشعيرات الدموية في الأكمام وتشديد المناسب. استخدام الأسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض فشكل كمذيب أخذ العينات في هذه التجارب. تأمين الحقنة في مضخة الحقنة على مطياف الكتلة.
ضع تأين النانو أو نانو ESI الباعث ما يقرب من ملليمتر واحد إلى فتحة أنبوب نقل أيون الموسعة. استخدام نظام معالجة الخلية للسيطرة على الحركات spacial من التحقيق واحد ووضع نانو ESI باعث مركزيا أمام أنابيب نقل أيون الموسعة. Pipette الخلايا من قارورة زراعة الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.
تدور الخلايا في 400 مرة G في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق والتخلص من افرا. resuspend الخلايا في أربعة ملليلترات من متوسطة RPMI تحتوي على مركب المخدرات في تركيز العلاج المطلوب. تخصيص المعلمات التجريبية لمطياف الكتلة.
ضمن عنوان وضع المسح الضوئي لبرنامج الجهاز، حدد تحديد الفحص. استخدام قرار من 60،000 في M عبر Z 400، واحد microscan 100 ميلي ثانية أقصى وقت الحقن والتحكم التلقائي في اكتساب. تحت مضخة حقنة، حدد معدل تدفق 150 نانولترز في الدقيقة الواحدة.
حدد مصدر NSI وتطبيق الجهد من حوالي 4.5 كيلوفولت. قم بتشغيل المجهر المقلوب عند التكبير 40 مرة المحدد لكل من اللوحة العلوية والعدسة السفلية. قم بتوصيله بمنفذ USB للكمبيوتر المحمول لالتقاط خلاصات الفيديو المباشرة.
بدوره على لوحة ساخنة وتعيينها إلى 37 درجة مئوية. على الكمبيوتر، انتقل إلى علامة التبويب الحصول على البيانات وحدد باستمرار ضمن الوقت المكتسبة. لإعداد العينة للتحليل، الماصات اثنين إلى ثلاثة من العينة في غطاء طبق بتري صغير.
ضع العينة في مركز الضوء من المجهر المقلوب على قمة اللوحة الساخنة. إعداد خلية الزجاج اختيار التحقيق للتحليل. استخدام نظام التلاعب الخلية لنقل التحقيق بحيث يتم التركيز على أعلى تحت microcsope مقلوب في نفس الطائرة كخلايا.
استخدم نظام معالجة الخلية لنقل تلميح مسبار تحديد الخلية إلى خلية مستهدفة للتحليل. يتم رصد هذه العملية باستخدام المجهر المقلوب. بدوره بلطف مقبض من المصبر لضبط موقف من الزيت المعدني داخل الأنابيب.
يتم توفير شفط لطيف من قبل الحقن المجهري لتأمين الخلية المستهدفة إلى طرف مسبار اختيار الخلية. استخدام نظام معالجة الخلية لنقل الخلية في الخلية تلميح التحقيق اختيار إلى طرف التحقيق واحد باستخدام المجهر الرقمي تركز على طرف التحقيق واحد لرصد هذه العملية. وتستخدم خلايا K-562 غير المعالجة لإنشاء طريقة تجريبية.
في تجربة SCMS نموذجية، يمكن ملاحظة تغيرات واضحة من أطياف الكتلة من نقل خلية أثناء الكشف عن محتويات الخلوية وبعد الانتهاء من القياس. ثلاث قمم مشتركة للدهون الخلوية بما في ذلك PC 34:4، PC 36:4، PC 38:5 يتم مراقبتها لضمان نقل الخلية بنجاح والكشف عن محتويات الخلوية. يتم تأكيد هوية العديد من أجهزة الكمبيوتر في نطاق كتلة من 750 إلى 850 باستخدام MSMS على عينات الخلايا غير المعالجة.
باستخدام المسبار المتعدد التشوّع ICMP الذي تم إعداده، تم اكتشاف Gemcitabine وSicol وOSW1 بعد الحضانة مع خلايا K-562. هذه النتائج تشير إلى أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة الدهون داخل الخلايا, المخدرات, والايض على مستوى الخلية واحدة من الخلايا في حل في بيئة محلية قريبة. تذكر أن تضع بشكل آمن الخلية اختيار التحقيق في حامل ماصة العالمي بحيث يمكن تطبيقها على نحو كاف.
ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على عينات المستمدة من المريض للتمييز بين الاختلافات بين الأيض الخلوية من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا, الذي يسمح لنا للحصول على فهم أفضل لهذه الحالات المرض. بعد تطوير هذه الطريقة، يمكننا تنفيذ القياس الكمي لمركبات المخدرات على مستوى الخلية الواحدة. عند العمل مع الخلايا، من المهم أن يكون لديك معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.
ويمكن استخدام ارتداء العين إضافية عند العمل مع الزجاج.
نظرة عامة
تم تطوير منصة متكاملة لمعالجة الخلايا من أجل التحليل عبر الإنترنت للخلايا المعلقة الفردية باستخدام مطياف الكتلة أحادي الاستشعار في ظل الظروف المحيطة. تتيح هذه الطريقة دراسة التغاير الخلوي في بيئة قريبة من الطبيعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- مطياف الكتلة
- تحليل الخلية الواحدة
الخلفية
- تحلل هذه التقنية الخلايا مباشرة من المحلول.
- تتطلب تحضيرًا بسيطًا للعينة.
- قابلة للتطبيق في دراسة الخزعات السائلة من حالات مرضية مختلفة.
- تمكن من تحليل عينات الخلايا المشتقة من المرضى.
هدف الدراسة
- لدراسة التغاير الخلوي.
- لتحليل الدهون، والعقاقير، والمركبات الأيضية داخل الخلية على مستوى الخلية الواحدة.
- لتطوير طريقة للتحليل في الوقت الحقيقي للخلايا الفردية.
الطرق المستخدمة
- تحضير مسابر زجاجية متدرجة لمعالجة الخلية.
- استخدام نظام معالجة الخلايا المقترن بمطياف كتلة.
- تطبيق التأين بالرش الكهروستاتيكي النانوي لإدخال العينة.
- مراقبة أطياف الكتلة أثناء نقل الخلية وتحليلها.
النتائج الرئيسية
- اكتشاف ناجح للمحتويات الخلوية أثناء مطياف الكتلة.
- تحديد قمم الدهون التي تؤكد نجاح نقل الخلية.
- اكتشاف عقاقير مثل جيمسيتابين وتاكسول في خلايا K-562.
- تدليل قابلية تطبيق هذه الطريقة لدراسة أنواع مختلفة من الخلايا.
الاستنتاجات
- تتيح المنصة المتكاملة تحليلًا فعالًا للخلية الواحدة.
- توفر رؤى حول استجابات الخلايا لعلاجات الأدوية.
- يمكن استخدام هذه الطريقة في مزيد من البحث في بيولوجيا الخلية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
The integration of single-probe mass spectrometry with a cell manipulation platform enables direct, quantitative analysis of drugs and metabolites in individual suspension cells from patient-derived samples. This approach addresses the challenge of studying cellular heterogeneity and drug response in a near-native environment, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The platform's minimal sample preparation and compatibility with liquid biopsies position it as a valuable asset for risk-adjusted portfolio decisions in disease biology and personalized medicine.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying intracellular drug and metabolite levels in single cells.
- Supports biological de-risking by revealing cellular heterogeneity and functional target engagement in patient-derived samples.
- Facilitates predictive confidence and triage of targets based on direct molecular readouts from disease-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers reproducible, quantitative mass spectrometry outputs for assay standardization and benchmarking.
- Enables scalable, high-content analysis of drug uptake and metabolism at the single-cell level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling analysis of patient-isolated cells from body fluids.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting liquid biopsy and disease-state profiling.
- De-risks advancement decisions by offering direct evidence of drug action in clinically relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This platform bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling direct, quantitative analysis of single suspension cells from clinical samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through single-cell drug and metabolite profiling.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects in heterogeneous cell populations.
- Analytics: Delivers high-resolution, quantitative mass spectrometry data for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery outputs to preclinical and clinical biomarker strategies using patient-derived cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical capability for diverse disease models and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by resolving cellular heterogeneity at the molecular level.
- Operational Value: Streamlines workflows with minimal sample preparation and robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing actionable data from clinically relevant samples.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of programs based on direct evidence from patient-derived cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell manipulation, mass spectrometry, and data interpretation.
- Demands specialized instrumentation, including microinjectors, inverted microscopes, and high-resolution mass spectrometers.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and analytical protocols.
- Adaptable to various cell types and body fluids, but may require optimization for specific disease models.
- Practical limitations include throughput and the need for precise cell selection and transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Glass Cell-Selection Probe Fabrication and Integrated Cell Manipulation Platform Assembly
2:32
Couple the ICMP with a Single-Probe Setup and Suspended Cell Sample Preparation
3:58
Perform SCMS Measurements Using the ICMP/Single-probe Setup
5:57
Results: Integrated Cell Manipulation Platform Testing of Single Suspension Cells
7:07
Conclusion
