إعداد وتوصيف Nanoliposomes لفخ البروتينات الكروية المائية النشطة بيولوجيا

سيتم إعداد الكبسولات النانوية الدهنية بواسطة تقنية البثق خطوة بخطوة في فخ القارين 48 كيلودالتون globular في البروتين المائي المنقى من الإسكونتا colocasia سيتم إثباته. جميع الإجراءات لتحديد خصائص الكبسولات النانوية تشمل المجهر الإلكتروني المسح وسيتم أيضا اتباع تشتت الضوء الديناميكي. يمكن أن تواجه إجراءات التبويب بعض التحديات من اختيار الدهون إلى تحقيق التغليف عالي الكفاءة ، والحفاظ على النشاط الحيوي للجزيئات المحنط.

ويمكن للبروتوكول الذي سيتم وصفه أن يتغلب على بعض هذه الصعوبات. وزن مكونات الليبوزوم باستخدام توازن تحليلي. قم بتبخير مكونات الدهون في الكلوروفورم باستخدام قارورة حجمية تناسبها في المبخر الدوار لتجنب فقدان المواد.

يُحرّك المزيج عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. إزالة الكلوروفورم باستخدام المبخر الدوارة. ضبط الفم قارورة الحجمي إلى الموقف القياسي للحصول على أفضل كفاءة، في حين في اتصال مع الماء من حمام التدفئة.

تعيين المعلمات وفقا للبروتوكول الموصوف. بعد حوالي 25 دقيقة، وإزالة القارورة، والتخلص من المذيبات المتبخرة بشكل مناسب. يتم تشكيل فيلم رقيقة ومبهمة ويمكن تصورها بسهولة.

هيدرات فيلم الدهون في محلول كبريتات الأمونيوم التي تحتوي على القارين في مليغرام واحد لكل ملليلتر. يُحرّك الخليط لمدّة 40 دقيقة ويُحتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم، سونيكات تعليق لمدة دقيقة واحدة في 25 درجة مئوية، ودرجة حرارة الغرفة.

للحد من حجم الفُيَس وتجنب التجميع، ضع غشاء البولي بين اثنين من دعامات الفلتر قبل الرطب وضعه في الحامل. أدخل حقنة فارغة واحدة في الجهاز، وملء الأخرى بميليلتر واحد من التعليق liposomal، وإدراجها على الجانب الآخر. إجراء 12 دورة البثق من خلال 2 ميكرومتر بولي كربونات المسام غشاء.

دفع العينة من حقنة واحدة إلى أخرى ببطء. في النهاية، يجب أن يصبح التعليق liposomal واضحة أثناء عملية النزهة، نتيجة للحد من حجم. يمكن أن يتم فقدان حوالي 2 ملليلتر من العينة أثناء هذه الخطوة.

فصل liposomes عن طريق الطرد فائقة التركيز. أولاً، وزن العينة في أنبوب التيتانيوم وتحقيق التوازن بين الأنابيب. تحقق من الحد الأدنى لحجم التي سيتم ملؤها، وإذا لزم الأمر، ضبط وحدة التخزين مع كبريتات الأمونيوم.

تناسب أنابيب التيتانيوم في دلو سوينغ. افتح باب جهاز الطرد المركزي ووضع الدوار في الداخل. أغلق باب جهاز الطرد المركزي، والفراغ الصحفي، وانتظر حتى يصل الفراغ من 200 إلى أقل من 20 ميكرون.

اضبط المعلمات في شاشة الطرد الفائقة. اضغط على الاستدعاء، وتحقق من الظروف، وابدأ تشغيل. بعد 90 دقيقة، الافراج عن فراغ عن طريق النقر على زر فراغ وفتح باب الطرد المركزي.

إزالة الدوار من الداخل. الحفاظ على عينة فائقة التركيز على الجليد ومن ثم فصل سوبرنات من بيليه، عن طريق تحويل أنبوب رأسا على عقب، إلى جهاز طرد مركزي يمكن التخلص منها 59 مليون لفصل عظمى من بيليه. تخزين فائقة تحتوي على البروتين غير المُكتَبَّل عند أربع درجات مئوية.

سيتم استخدام هذا لتحديد كفاءة التغليف. يتم تقديم بيليه كهلام شفاف. تعليق بيليه والحرارة HEPES المخزنة محلول ملحي.

الرجاء مراجعة البروتوكول للحصول على مزيد من المعلومات. تحديد كفاءة التغليف من قبل بروتوكول بيترسون، من أجل تجنب تدخل الدهون في كمية البروتين. وينبغي تحليل العينات في ثلاث ية.

في أنبوب microfuge، تمييع شفة عظمى أو BSA في واحد مليغرام لكل ملليلتر مع الماء إلى حجم النهائي من ملليلتر واحد. أضف DOC واحتضان لمدة 10 دقائق. إضافة 1 ملليلتر من 72٪ TCA واخلط جيدا.

جهاز طرد مركزي في 3،000 غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل بعناية المافق عن طريق تجنب أنبوب أسفل، ووضعها على ورقة ماصة والسماح لها الجافة. تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الماء.

تخلط جيدا للتأكد من حل بيليه. ثم، نقل العينة إلى أنابيب الاختبار. إضافة ملليلتر واحد من الكاشف A، مزيج واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

إضافة 5 ملليلتر من الكاشف B، مزيج واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. تحديد امتصاص في 750 نانومتر وحساب كفاءة التغليف. يتم تحديد متوسط الحجم وتوزيع الحجم بواسطة تشتت الضوء الديناميكي.

نقل نانوفيسلات الليبوسوم إلى cuvette التحجيم المتاح. تناسب cuvette داخل المعدات. تعيين معلمات المعدات.

لتحديد الاستقرار، وتخزين liposomes في أربع درجات مئوية والتحقق من توزيع حجم ومتوسط الحجم بانتظام. يتم تنفيذ توصيف الليبوسومات عن طريق مسح المجهر الإلكتروني وفقا لمرتا وRamasamy في ثلاثية. إصلاح زلات الغطاء الزجاجي في الجزء السفلي من طبق بيتري مع شريط.

معطف الغطاء ينزلق مع بولي-L-ليسين. ضع ورقة تصفية مبللة داخل طبق بيتري للحفاظ على الرطوبة واحتضان لمدة ساعة واحدة. شطف مع الماء المقطر.

إضافة قطرة من العينة والسماح لها لتجف لمدة ساعة واحدة، في درجة حرارة الغرفة. لإصلاح العينات، وتغطيتها بالغلوتارالدهيد، المعدة في عازل الفوسفات. ضع أوراق التصفية الرطبة داخل طبق بيتري.

من المهم أن ختم طبق بيتري. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة. شطف الغطاء ينزلق ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من، مع نفس العازلة الفوسفات.

يجفف العينات على النحو التالي عن طريق الغسيل في محلول تركيز الإيثانول المتزايد من 35٪ إلى الإيثانول المطلق. كيميائياً الجافة العينات مع سداسية الميثيلديسيلازان لمدة 10 دقائق. وينبغي التلاعب سداسيةthyldisilazane بعناية داخل غطاء محرك الدخان.

يجب السماح للعينات بالجفاف بين عشية وضحاها داخل مجفف أو داخل غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة. جبل العينات المجففة على كعب، مع شريط لاصق موصل الكربون. ابصق كعب مع الذهب.

تسجيل الصور SEM مع المجهر الإلكتروني المسح الضوئي، SEM، في وضع فراغ منخفض والجهد المنخفض، 20 كيلوفولت. يصف الشكل الأول إعداد الليبوسومات النانوية. فوسفوليبيدس، مخدر، ربط، وخماوي، مكونات ليبوسوم الرئيسية، تم حلها لأول مرة في الكلوروفورم للحصول على فيلم الدهون.

ثم تم إعادة تهوية فيلم الدهون في عازلة المالحة، التي تحتوي على البروتين المائي، والقطين، ليكون entrapt، وينبغي أن تكون الحضانة preformed بين عشية وضحاها. ثم، يتم تطبيق سونيكيشن وبثق لتوليد هييكليس unilamellar الصغيرة. تفصل خطوة الطارد الفائقة بين إعداد الدهون الدهنية من الدهون المجانية، والبروتين غير المقنوم.

في حين يتم استخدام supernatant لتحديد كفاءة الفخ. يعرض نانوليبوسومات المنتجة باستخدام المنهجية المذكورة أعلاه توزيع حجم يتراوح بين 51 و 396 نانومتر، ومتوسط حجم 155 نانومتر. التحضير متجانسة، منذ مؤشر polidispersity هو من 168.

يتم التوصل إلى كفاءة فخ عالية من 83٪إذا تم بثق liposomes من خلال 2 ميكرومتر المسام حجم غشاء. تم تقييم خصائص نانوليبوسومات المورفولوجية عن طريق مسح المجهر الإلكتروني. وينبغي أخيرا علاج الليبوزومات على نحو مماثل للخلايا الحية، للحصول على صور ذات جودة أفضل.

إجراءات التثبيت والتجفيف مهمة لضمان التصور من أصغر الحفيات سليمة التي تدعم أكثر من 20 كيلوفولت في ظل ظروف فراغ. الأرقام 2A و 2B عرض الحويصلات الدهنية على شكل جولة في حدود 121 نانومتر، وتحليلها في 20 كيلوفولت. في حين أن الأرقام 2C و 2D، وعرض العينات غير مستعدة بشكل كاف.

سمحت عينات أساء فقط لمراقبة من إتلاف أو كبيرة حشي, أيّ يستطيع لا يقاوم فراغ وطبّيّة شروط. البروتوكول الموصوف، هنا في، سمح لإنتاج vesicles استنساخ عرض شكل دائري، سطح صغير، ومتوسط حجم ما يقرب من 150 نانومتر. ويمكن استخدام هذه الطريقة لالقاء الجزيئات المعقدة والكبيرة، كبروتين رباعية سخيرية، مما يعرض مصحح ماء.

نقص الفخ الذاتي هو أعلى من 80٪، ومعدل التسرب منخفض جدا، أدنى من 1.5٪عندما يتم تخزين الكبسولات النانوية في أربع درجات مئوية. نأمل أن يساعدك هذا الفيديو في تغليف الجزيئات الكبيرة ، مثل teri.