نموذج خط خلية Murine القائم على تثبيط CDK9 المزمن لدراسة عيوب الاستطالة غير الوراثية الواسعة الانتشار (TE^{بالتأكيد)}في السرطانات

وبالنظر إلى أن سرطانات TEdeff هي حاجز كبير ضد العلاج المناعي ، فإن نموذجنا الدوائي هو أداة مفيدة لأنه يحاكي بشكل مناسب العيوب النسخية والجينية الواسعة الانتشار التي لوحظت في مثل هذه السرطانات ، ويسمح للمرء بدراسة هذه التشوهات غير الوراثية للحصول على رؤى جديدة ، أو العثور على استخدامات جديدة للأدوية الموجودة ، أو العثور على استراتيجيات جديدة ضد مثل هذه السرطانات. هذا هو سهل لإنشاء ونموذج قابل للتعميم لدراسة عيوب استطالة النسخ في السرطان, تمكين واحد لدراسة التفاعلات الورم المناعي في كل من المختبر وفي الجسم الحي. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على خطوط سرطان الإنسان.

لقد اختبرنا هذا على T47D و CAL51 على المدى القصير ، مما أدى إلى خصائص مماثلة مثل TEdeff. البروتوكول الذي يصفه هنا يعطي إطارا أساسيا لتقليل المتغيرات المعروفة الحاسمة لتوليد الميزات الشبيهة بـ TEdeff بواسطة تثبيط CDK9 المزمن. ومع ذلك, يجب توخي الحذر لتحسين الجرعة sublethal الدقيق من فلافروبيريدول لخطوط مورين أخرى.

تأثير الاختلاف في كثافة طلاء الخلايا، ظروف الثقافة، قد تختلف ظروف تحفيز السيتوكين لمختلف خطوط مورين الخلية. تبدأ عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي البولي إيجابية من نصف عينات الريبوزومية المستنفدة سابقا باستخدام الخرز المغناطيسي oligo dT. إعادة تعليق الخرز في القارورة عن طريق دوامة لمدة 30 ثانية، ونقل 200 ميكرولترات من الخرز إلى أنبوب.

إضافة وحدة تخزين متساوية من المخزن المؤقت الربط وخلط المحتويات. ضع الأنبوب في مغناطيس لمدة دقيقة واحدة، وتجاهل المابير. ثم، وإزالة أنبوب من المغناطيس، وإعادة ربط الخرز غسلها في 100 ميكرولترات من العازلة ملزمة.

ضبط حجم عينة الريبوزوم RNA المنضب إلى 100 ميكرولترات مع 10 ملليمولار تريس-HCl في درجة ح H 7.5. إضافة 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت الربط إلى العينة. سخني الخليط إلى 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتعطيل هياكل الحمض النووي الريبي الثانوية ، ثم وضعه على الجليد على الفور.

إضافة 200 ميكرولترات من مجموع الحمض النووي الريبي إلى 100 ميكرولترات من الخرز غسلها، واخلط جيدا على الدوار لمدة خمس دقائق. وضع أنبوب على المغناطيس لمدة دقيقة إلى دقيقتين، وإزالة بعناية جميع عظمى، ثم إزالة الأنبوب من المغناطيس، وإضافة 200 ميكرولترات من الغسيل العازلة. خلط بعناية العينة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات، والعودة الأنبوب إلى المغناطيس لمدة دقيقة واحدة، وإزالة supernatant.

ثم استخدم مقياس الطيف لقياس نقاء وتركيز مرنا المعزول المربوطة بالخرز. استخدام النصف المتبقي من عينة RNA الريبوزومية المنضب كمدخلات للبروتين A الأعمدة إلى الارناس RNAAs الخمسة ذات الـ prime من دون كلل مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة 7-ميثيل غوانوسين. غسل البروتين الخرز المغناطيسي من عدة RIP وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لربط ما قبل الجسم المضاد إلى الخرز، من الأجسام المضادة 7-الميثيلقوانوسين إلى الخرز علقت في 100 ميكرولترات من عازلة الغسيل من عدة.

احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران بسرعة منخفضة. ثم الطرد المركزي الأنابيب لفترة وجيزة، ووضعها على الفاصل المغناطيسي. إزالة وتجاهل supernatant، ثم اتخاذ الأنابيب قبالة الفاصل المغناطيسي، وإعادة تعليق الخرز مع 500 ميكرولترات من عازلة الغسيل.

دوامة الأنابيب، الطرد المركزي لهم لفترة وجيزة، ووضعها مرة أخرى على الفاصل المغناطيسي، والتخلص مرة أخرى من الفائق. ثم، إضافة 120 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنضب الجيش الملكي النيبالي إلى الخرز المضادة ملزمة جنبا إلى جنب مع ميكرولتر واحد من مثبط RNase، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 إلى 90 دقيقة مع الانفعالات خفيفة. بعد الحضانة، تدور أسفل العينة في 300 مرة ز لمدة 10 ثانية، ونقل سوبرنا مع مرنا غير المغطاة إلى أنبوب جديد microcentrifuge.

كرر غسل مرتين مع 100 ميكرولترات من العازلة غسل، وبركة عظمى التي تم جمعها. Elute MRNA توج من الخرز عن طريق إضافة 300 ميكرولترات من عازلة تحلل اليوريا أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطة وتسخين الخليط إلى 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. الجمع بين 300 ميكرولترات من العينة مائل مع 300 ميكرولترات من الفينول: الكلوروفورم: الكحول الأيزوميل، عكس لمزيج، وترك لمدة 10 دقائق.

بلطف مزيج العينة مرة أخرى، والطرد المركزي لمدة دقيقتين. بعناية ماصة الطبقة العليا إلى أنبوب جديد، وتجاهل الطبقة السفلية. إضافة 300 ميكرولترات من 2-بروبانول و 30 ميكرولترات من خلات الصوديوم ثلاثة المولر إلى العينة، عكس ذلك عدة مرات، ووضعها في ناقص 20 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.

بعد الحضانة، الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل بعناية فائقة، وتجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. Resuspend بيليه في المياه الخالية من النوى، وقياس نقاء وتركيز الجيش الملكي النيبالي مع مطياف.

عزل الخلايا إيجابية CD8 وفقا لاتجاهات المخطوطة، ثم إعادة تعليق الخلايا في العازلة المتاحة تجاريا نظام الفصل المغناطيسي. إضافة 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة لكل ملليلتر واحد من الخلايا، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة. ثم، إضافة 100 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي لكل 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة، وترك الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة أخرى.

بعد الحضانة ، إضافة سبعة ملليلتر من العازلة الفاصل المغناطيسي إلى الخلايا ، aliquot ثلاثة إلى أربعة ملليلتر إلى أنبوب جديد ، ووضع الأنبوب على المغناطيسي لمدة خمس دقائق. Decant السائل مع الخلايا إيجابية CD8 إلى أنبوب جديد على الجليد. ثم، إضافة ما تبقى من ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الخلايا إلى الخرز المغناطيسي، ووضع الأنبوب على المغناطيس لمدة خمس دقائق.

Decant الدفعة الثانية من الخلايا إيجابية CD8 إلى أنبوب مع الدفعة الأولى. البذور المهندسة الخلايا الدهنية السامبوك الليفية جنبا إلى جنب مع جزيء تحفيزية المشتركة في 75،000 الخلايا في بئر في لوحات 24-جيدا، وثقافتها في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون حاضنة مرطب. بعد 24 ساعة، اغسل الطبقة الأحادية APC مرة واحدة مع وسط دولبيككو المعدلة في إيسكو، وأضف 0.5 مرة 10 إلى الخلايا الست الساذجة في مليلترين من المتوسط تكمل وفقا لاتجاهات المخطوطة.

زراعة الخلايا لمدة 20 ساعة، ثم حصاد بلطف الخلايا OT-I nonadherent عن طريق جمع وسائل الإعلام وتكتكية الخلايا في 191 مرة ز لمدة دقيقتين. عد الخلايا، وبذر لهم بنسبة واحد إلى واحد في ثقافة المشتركة مع B16/F10، B16/F10-OVA غير المعالجة، والخلايا B16/F10-OVA المعالجة مسبقا مع flavopiridol. زراعة الخلايا لمدة 20 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة ترطيب ثاني أكسيد الكربون، ثم إزالة الخلايا إيجابية CD8 OT-I، وغسل الخلايا B16/F10-OVA المنضمة في برنامج تلفزيوني.

تريبسينز المجموعات الثلاث من الخلايا المرفقة في 05٪ EDTA مع التربسين لمدة خمس دقائق، ثم بيليه لهم في 191 مرات ز لمدة خمس دقائق. احتضان الخلايا المحصودة B16/F10-OVA في PBS الباردة مع صبغة البقاء والأجسام المضادة ذات الصلة، ثم تحليل الجدوى مع تدفق الخلايا. وقد استخدم هذا البروتوكول لإنشاء نموذج خلية معيبة استطالة النسخ الذي يظهر خسارة عميقة من الفوسفور في موقف سيرين 2 على المجال تكرار C-محطة من RNA بوليميراز الثاني وانخفاض كبير في H3K36me3، الذي تورط في تحديد حدود exon وتمنع النسخ خفي هارب.

تظهر الخلايا عيوب معالجة مرنا الحرجة مع زيادة نسب mRNAs المتوجة بشكل غير صحيح وغير polyadenylated. وعلاوة على ذلك، لوحظ قمع محدد لجينات مسار الاستجابة الالتهابية الرئيسية وموت الخلايا بوساطة فاسل في نموذج الخلية هذا. اختبار استكشافي لاختبار ما إذا كان نموذج الخلية يمنح مقاومة لهجوم الخلايا تي السامة للخلايا يظهر أن عيوب استطالة النسخ المزمنة التي يسببها فلافوبيريدول يمكن أن تمنح وسيلة للهروب من هجوم المناعة المضادة للورم.

Flavopiridol- تعامل B16/F10 الخلايا بشكل ثابت overexpressing الجين OVA لم تكن عرضة لCD8 إيجابية الخلايا التائية السامة للخلايا, التي لديها سمية انتقائية نحو الخلايا OVA التعبير عن. وخضعت الخلايا غير المعالجة المسبقة مع flavopiridol وفاة الخلايا الرئيسية، في حين أن الوالدين B16/F10 التي لا تعبر عن مستضد OVA نجا. من المهم أن نتذكر أن الحد في phosphoserine 2 وH3K36 تريثييليشن مستوى على 25 نانومولار فلافوبيريدول علاج لا يضمن انخفاضا في كل من phopsho-STAT1 وphospho-NF-كاباب مستوى.

كل خط سرطان الماوس هي فريدة من نوعها، وJAK1 وCCNT1 قد إنقاذ تأثير flavopiridol. بالإضافة إلى ذلك, يمكن استخدام هذا النموذج في الجسم الحي لرصد المقاومة التي تقدمها سرطانات TEdeff ضد الاستجابات المناعية المضادة للورم الفطرية والتكيفية. على سبيل المثال، يمكن استخدام العلاجات المضادة لآسيالو لتنظيم نشاط خلايا NK، ويمكن إعطاء العلاج بالنقاط المناعية للفئران الحاملة للورم TEdeff.

الحمل الليمفاوي الذي يتسلل إلى الورم، أو TIL، هو مؤشر على النجاح في العلاج المناعي. وقد مهد نموذجنا الطريق لنا لاستكشاف مدى تفعيل واستنفاد TILs في بيئة سرطان TEdeff قبل وبعد العلاج المناعي.