تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)
يوليو 10, 2019
هنا، نقدم بروتوكوللإثراء مواقع ربط الحمض النووي الريبي الذاتية أو "آثار أقدام" من RNA: البروتين (RNP) المجمعات من خلايا الثدييات. وينطوي هذا النهج على هطول يناهي الأمطار المناعية للوحدات الفرعية RNP، وبالتالي يطلق عليه اسم الترسيب المناعي للرنا جنبا إلى جنب (RIPiT).
رنا المناعة جنبا إلى جنب متبوعا بالتسلسل، أو RIPiT-Seq، هو وسيلة لتحديد ما هي المناطق من الجيش الملكي النيبالي ملزمة بزوج معين من البروتينات ملزمة RNA. الميزة الأكثر فريدة من RIPiT هو قدرته على استهداف اثنين من البروتينات المختلفة في تنقية اثنين. وهذا يوفر وسيلة قوية لإثراء مركب بروتين الحمض النووي الريبي متميز من المجمعات الأخرى.
أيضا، RIPiT-Seq هو UV crosslinking مستقلة، ويمكن تطبيقها على العديد من البروتينات التي تعمل على RNA دون ربط مباشرة. في حين أن هذه الطريقة لا تمتد مباشرة نحو العلاج أو التشخيص، وقد ارتبطت البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة ومعالجة الحمض النووي الريبي مع العديد من الأمراض مثل اعتلال الأعصاب والسرطان. RIPiT-Seq يوفر أداة لدراسة وظائف البروتينات المرتبطة بالأمراض الحمض النووي الريبي ملزمة.
RIPiT-Seq يتطلب نظام حيث يمكن التعبير عن البروتين الموسومة epitope. وقد تم اختباره فقط في خلايا HEK293، وهو الأكثر قابلية لثقافة الخلية. ومع ذلك، الآن مع قدرتنا على وضع علامة على البروتينات باستخدام CRISPR، RIPiT-Seq يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على النظم الحديثة المتنوعة.
يعتمد نجاح RIPiT على اثنين من الاعوداد المناعية الفعالة ، لذلك سيكون من الضروري تحسين ظروف المناعة للجسم المضاد المستخدم. أيضا، العمل مع الجيش الملكي النيبالي يتطلب الاحتياطات المناسبة، لذلك ينبغي استخدام الكواشف الخالية من RNase أثناء وبعد استخراج الحمض النووي الريبي. إثبات الإجراء سيكون لورين وودوارد، طالبة دراسات عليا في مختبري.
ابدأ بغسل الخلايا أحادية الطبقة بلطف مع 15 ملليلتر من PBS المبردة لكل لوحة 15 سنتيمترًا. ثم كشط من الخلايا إلى 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وجمعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، والتخلص من supernatant.
إضافة أربعة ملليلترات من الجليد الباردة العازلة تحلل تحلل واستخدام ماصة P1000 لإعادة تعليق الخلايا. نقل lysate إلى أنبوب خمسة ملليلتر واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. ضع الليسات في حمام جليدي و sonicate وفقًا لاتجاهات المخطوطات.
ثم إضافة 108 ميكرولترات من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس لضبط تركيز الملح إلى 150 ملليمولار. ثم، الطرد المركزي في 12،000 ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، وجمع 20 ميكرولترات من عظمى لتحليل لطخة الغربية. قبل غسل الخرز العلم agarose وفقا لاتجاهات المخطوطات وتطبيق السوبر المتبقية إلى 750 ميكرولترات من الخرز في أنبوب خمسة ملليلتر.
احتضان الخرز agarose العلم مع استخراج الخلية لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف. بعد الحضانة، بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي في 400 غرام لمدة دقيقة واحدة في أربع درجات مئوية، وجمع 20 ميكرولترات من ااغض لتحليل لطخة الغربية. تجاهل الماخرة المتبقية وغسل الخرز عن طريق resuspending لهم في أربعة ملليلتر من العازلة غسل ايزو.
بيليه الخرز مرة أخرى وإزالة supernatant. تمييع RNase I في 750 ميكرولترات من مخزن الغسيل ISO وفقا لاتجاهات المخطوطات، وإضافته إلى الخرز agarose العلم. احتضان الخليط في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف، ثم بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي.
جمع 20 ميكرولترات من supernatant لتحليل البقعة الغربية ، وتجاهل بقية. ثم، وغسل الخرز مع تخزين غسيل ISO كما هو موضح سابقا. المقبل، أداء elution تقارب بإضافة 375 ميكرولترات من عازلة elution إلى الخرز، وهز الخليط بلطف في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.
بعد الحضانة، بيليه الخرز وجمع 15 ميكرولتر aliquot من elution لتحليل لطخة الغربية. بينما هو جار elution تقارب، أداء الخرز المغناطيسي المضاد للجسم. تبدأ عن طريق غسل 50 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي في ملليلتر واحد من ايزو غسل العازلة.
resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من العازلة اقتران وإضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة. ثم، احتضان الخرز لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غسل الخرز المغناطيسي مرتين مع العازلة اقتران وإعادة ربط الخرز في 375 ميكرولترات من العازلة التخفيف RIPiT.
تخزين الخرز على الجليد حتى المناعة. تطبيق elution تقارب العلم إلى الخرز المغناطيسي المضادة- مقترنة واحتضان مع خلط لطيف لمدة ساعة إلى ساعتين في أربع درجات مئوية. التقاط الخرز المغناطيسي مع المغناطيس وجمع 15 ميكرولترات من عظمى لتحليل البقعة الغربية.
ثم، وغسل الخرز سبع مرات مع تخزين غسيل ايزو. المضي قدما في denaturing elution عن طريق إعادة حبات المغناطيسي في 100 ميكرولترات من عازل عينة واضحة وتحتضن التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق. أثناء الاحتضان، نفض الغبار دوريا الخرز لإعادة تعليق لهم.
التقاط الخرز المغناطيسي على المغناطيس وجمع 15 ميكرولترات من elution لتحليل البقعة الغربية. نقل elution المتبقية إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. لاستخراج الحمض النووي الريبي، إضافة 320 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase و 400 ميكرولترات من الكحول ايساميل الفينول الكلوروفورم إلى elution RIPiT.
دوامة الخليط ومن ثم الطرد المركزي في 12،000 غرام لمدة خمس دقائق. جمع 350 ميكرولترات من المرحلة مائي في أنبوب منفصل. إضافة خلات الصوديوم، كلوريد المغنيسيوم، الجليكوجين، والإيثانول إلى العينة التي تم جمعها وتحتضن الخليط بين عشية وضحاها في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية.
في اليوم التالي, بيليه الجيش الملكي النيبالي من قبل الطرد المركزي في 12, 000 غرام لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية وغسلها في 70٪ الإيثانول. بعد غسل الإيثانول، تعامل مع الحمض النووي الريبي T4 مع كيناز متعدد النوى، أو PNK، دون أي ATP، وإجراء تنقية الفينول الكلوروفورم وفقا لاتجاهات المخطوطات. Resuspend RNA نظيفة في 4.5 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase.
لتحديد العائد RNA، radiolabel الجيش الملكي النيبالي مع PNK و 32P المسمى ATPs وفقا لتوجيهات المخطوطات. استخدام سلم الحمض النووي المدى المنخفض و 20 إلى 40 نيوكليوتيدات الاصطناعية oligo لحجم وكمية المعايير. حل الحمض النووي الريبي المسمى على 26٪ من هلام اليوريا بولياكريلاميد.
جفف الجل وفقًا لاتجاهات المخطوطة وتعرّض الجل إلى phosphoscreen حتى يتم اكتشاف إشارة كافية. وقد استخدمت هذه التقنية للتحقيق في التفاعلات بين مجمع مفرق إكسون أو EJC. تحليل البقعة الغربية من البروتينات تنقية من كل خطوة رئيسية في الإجراء RIPiT تبين أن EJC تنقية يحتوي على كل من EIF4A3 و MAGOH.
لم يتم الكشف عن التحكم السلبي، HNRNPA1، في elution. قوة إشارة البصمة الرنا يرتبط مع كمية تفاعل البروتين RNA. لوحظ وجود بصمة أقوى عندما تم تنفيذ RIPiT على الخلايا المعالجة بالبوروميسين ، مما يزيد من إشغال EJC على الحمض النووي الريبي.
لضمان أن RIPiT قد تم فعالة، من المهم لاختبار كفاءة الملكية الفكرية من قبل لطخة الغربية. من المهم أيضًا تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي قبل المضي في التسلسل العميق. في عام 2018 ، استخدم مختبر سينغ هذه التقنية بنجاح لتنقية نوعين من الاختلافات المتميزة من مجمع تقاطع exon وتحديد أنماط ربط الحمض النووي الريبي.
إذا اختار الباحثون الكشف عن آثار الحمض النووي الريبي مع التصوير الذاتي، ينبغي اتباع جميع إجراءات السلامة الإشعاعية المناسبة والبروتوكولات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لإثراء مواقع ربط الحمض النووي الريبي الذاتية للمجمعات الحمض النووي الريبي:البروتين من خلايا الثدييات باستخدام طريقة تسمى ترسيب الحمض النووي الريبي المناعي المتسلسل (RIPiT). تسمح هذه التقنية بتحديد مناطق الحمض النووي الريبي التي يرتبط بها بروتينات ربط الحمض النووي الريبي المحددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الجزيئي
- بيولوجيا الحمض النووي الريبي
الخلفية
- تلعب بروتينات ربط الحمض النووي الريبي أدوارًا حاسمة في العديد من العمليات الخلوية.
- فهم تفاعلات الحمض النووي الريبي:البروتين ضروري لدراسة تنظيم الجينات.
- يوفر RIPiT طريقة لتحليل هذه التفاعلات بشكل فعال.
- هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في سياق الأمراض المرتبطة ببروتينات ربط الحمض النووي الريبي.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لإثراء مجمعات الحمض النووي الريبي:البروتين.
- لتسهيل دراسة بروتينات ربط الحمض النووي الريبي المرتبطة بالأمراض.
- لتوفير أداة للباحثين الذين يدرسون آليات معالجة الحمض النووي الريبي.
الطرق المستخدمة
- تقنية ترسيب الحمض النووي الريبي المناعي المتسلسل (RIPiT).
- ترسبين مناعي يستهدف بروتينات ربط الحمض النووي الريبي المختلفة.
- تسلسل مناطق الحمض النووي الريبي الغنية.
- منهجية مستقلة عن الترابط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية.
النتائج الرئيسية
- إثراء ناجح لمجمعات الحمض النووي الريبي:البروتين المميزة.
- تحديد مناطق الحمض النووي الريبي التي يرتبط بها بروتينات ربط الحمض النووي الريبي المحددة.
- إثبات قابلية تطبيق المنهجية على بروتينات مختلفة.
- رؤى حول دور بروتينات ربط الحمض النووي الريبي في الأمراض.
الاستنتاجات
- RIPiT-Seq هو أداة قوية لدراسة تفاعلات الحمض النووي الريبي:البروتين.
- تعزز هذه المنهجية فهمنا لبروتين ربط الحمض النووي الريبي في سياقات الأمراض.
- قد تؤدي التطبيقات المستقبلية إلى رؤى حول الأهداف العلاجية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
RIPiT-Seq enables biopharma R&D teams to map RNA footprints of specific protein complexes without UV crosslinking, expanding targetable RNA-binding proteins in disease-relevant systems. This supports mechanistic de-risking by clarifying cooperative RNA:protein interactions in pathways linked to neuropathies and cancer. The method enhances predictive confidence in target validation by isolating compositionally distinct complexes from background noise.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies RNA regions bound by cooperative protein pairs, clarifying functional complexes in RNA regulation.
- Operational Value: Uses tandem immunoprecipitation to enrich specific RNA:protein interactions, reducing false positives from nonspecific binding.
- Predictive Value: Enables de-risking of RNA-binding protein targets by defining their functional partners in disease-associated pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative RNA footprint data for assessing binding site occupancy under experimental perturbations.
- Operational Value: Produces sequencing-ready libraries from purified RNA, enabling scalable profiling across conditions.
- Assay Readiness: Supports standardized workflows for comparing complex formation in wild-type versus perturbed cellular states.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to RNA-binding proteins implicated in neuropathies and cancer, supporting target linkage to disease mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase complex identification with preclinical validation of RNA regulatory functions.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs prioritization of targets by revealing cooperative dependencies that modulate RNA processing.
Pipeline & Workflow Integration
RIPiT-Seq fits within the discovery biology phase, providing mechanistic insights that inform lead identification and preclinical de-risking strategies for RNA-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about cooperative RNA-binding protein function by isolating footprints of defined complexes.
- Screening: Delivers quantitative, sequencing-based readouts that enable comparison of RNA occupancy across treatment groups.
- Analytics: Generates high-resolution RNA footprint maps that support statistical comparison of binding site enrichment.
- Translational Research: Connects complex-specific RNA binding to disease-relevant pathways, supporting biomarker-aligned target selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing RNA-protein interactions across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by resolving whether RNA-binding proteins act independently or in complexes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through dual purification steps that limit background and improve signal-to-noise.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions by clarifying mechanistic context of RNA-binding protein targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated cooperative interactions in disease-linked pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, RNA handling, and sequencing library preparation.
- Dependent on availability of high-quality antibodies for sequential immunoprecipitation of epitope-tagged proteins.
- Necessitates RNase-free environments and optimized lysis conditions to preserve RNA-protein complexes.
- Best suited for cell culture systems where epitope tagging via CRISPR or transfection is feasible.
- Limited by the efficiency of both immunoprecipitation steps, requiring optimization for each antibody-protein pair.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:40
Cell Harvesting and Formaldehyde Treatment
2:50
FLAG Immunoprecipitation and RNase I Digestion
4:09
Affinity Elution and Magnetic Bead-antibody Conjugation
5:14
Second Immunoprecipitation
6:12
RNA Extraction and Analysis
7:51
Results: RNA and Protein Yields
8:38
Conclusion
