نموذج استئصال الزائدة الدودية Murine من التهاب القولون المزمن المرتبطة سرطان القولون والمستقيم عن طريق توطين دقيق من التصحيح Caecal
أغسطس 24, 2019
يصف البروتوكول المعروض إزالة جراحية سهلة للتذييل (تصحيح caecal) في فأر يتبعه تحريض سرطان القولون والمستقيم المرتبط بمرض الأمعاء الالتهابي. هذا النموذج استئصال الزائدة الدودية murine تمكن من التحقيق في الدور البيولوجي للتذييل في مسببات الأمراض من أمراض الجهاز الهضمي البشري.
يصف البروتوكول العام الإجراءات الجراحية التي يتم تنفيذها بسهولة لإزالة التذييل المعروف باسم التصحيح caecal في الفئران. يمكن استخدام نموذج استئصال الزائدة الدودية المورين لدراسة الأدوار البيولوجية للتذييل في التسبب في أمراض الجهاز الهضمي البشري. التذييل البشري هو عضو متنازع عليه.
وقد أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الملحق يلعب دورا هاما في الحفاظ على صحة الأمعاء. لدراسة الوظيفة البيولوجية للتذييل، فإن توليد نموذج حيواني مرتبط باستئصال الزائدة الدودية مرتبط بالمرض أمر بالغ الأهمية. في هذا البروتوكول، سوف نصف خطوات بسيطة وآمنة الجراحية لإزالة الزائدة الدودية، والمعروفة باسم التصحيح caecal في الفئران.
لضمان نجاح هذا النموذج، هناك ثلاث خطوات رئيسية كما سترى في الفيديو التالي. أولاً، حدد مكان فئران الفئران قبل الجراحة. ثانياً، قم بعمل شق صغير في البطن.
ثالثا ، تطهير وإغلاق جذع caecum. الجزء الأول، استئصال الزائدة الدودية الفئران. إعداد أدوات جراحية معقمة وحلول تنظيف قبل الجراحة.
تخدير وتأمين الماوس على منصة في وضع supine عن طريق وضع أربعة شرائط من شريط لاصق طبي عبر الأطراف لمنع حركة الوضعية أثناء الجراحة. بلطف لمس البطن كله من الماوس للعثور على الشعور عثرة. تغطية الستائر وتطهير منطقة حلق من البطن الماوس واسعة قدر الإمكان باستخدام مرتين من اليود.
إجراء شق طولي يتراوح بين 0.5 سنتيمتر إلى سنتيمتر واحد في منتصف البطن. وفقا لموقع محدد سلفا من caecum، والبحث عن caecum وإضفاء مظهر بلطف لمدة سنتيمتر واحد تقريبا لتحديد التصحيح caecal. استخدم محلولًا فسيولوجيًا مُدفأًا مسبقًا ومعقّمًا لترطيب الأمعاء.
لمنع المضاعفات المحتملة من نزيف ما بعد العملية الجراحية والعدوى، ligate الأوعية الدموية mesenteric من caecum باستخدام 8-0 خياطه. هيدرات caecum مع المالحة. وضع علامة على منطقة استئصال باستخدام خياطة 4-0 مع حلقة مفتوحة بالقرب من قمة caecum في القولون القريب.
قطع التصحيح caecal تحت استئصال ملحوظ باستخدام مقص صغير والقضاء على محتوى caecal المتبقية مع مسحات القطن الطبية. تطهير جذع من caecum مع اليود. إغلاق الجذع مع خياطة تشغيل باستخدام 8-0 خياطه.
إزالة بعناية حلقة الموضوع 4-0، المستخدمة سابقا لوضع علامة على استئصال في جذع caecum. تعقيم الموقف خياطة باستخدام اليود. إعادة هيدرات منطقة القطع مع المالحة.
إغلاق طبقة العضلات مع خياطة تشغيل باستخدام 8-0 الخيط خياطة. أغلق طبقات الجلد باستخدام خياطة متقطعة مع 4-0 خياطة الخيط. تطهير قطع الجراحية مرتين مع اليود.
ثم، إزالة اليود باستخدام 75٪ الكحول الطبية. الوجه بلطف الماوس مرة أخرى. حقن تحت الجلد 0.1 مليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم من البوبرينورفين، و 0.4 ملليلتر من المالحة الفسيولوجية.
وبقية الماوس على وسادة الحرارة، حتى يعود إلى وعيه. وضع الماوس مرة أخرى إلى القفص العقيم، ومراقبة عن كثب الماوس لعلامات الألم لمدة ثلاثة أيام بعد الجراحة لضمان شفائها. الجزء الثاني: تحريض سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون مع أزوكسي الميثان، AOM، وDextran كبريتات الصوديوم، DSS، سبعة أيام بعد استئصال الزائدة الدودية.
ذوبان aliquot واحد من AOM وتمييعه إلى 1 مليغرام لكل ملليلتر باستخدام 0.9٪ المالحة العادية. تتم عملية التحضير بأكملها في غطاء الدخان. قم بحل أربعة غرامات مسحوق DSS في 200 ملليلتر محلول المياه autoclaved لإعداد 2٪ DSS.
كل قفص يحتوي على خمسة فئران. جعل حقن داخل الصفاق من AOM مع 0.01 ملليلتر لكل غرام لكل فأرة على أساس وزنه. استبدال المياه autoclaved مع 2 ٪ DSS لمدة خمسة أيام.
سيتم تغذية الفئران بالماء المُقلَد ذاتيًا لدورتين إضافيتين. الجزء الثالث: النتائج. تدفق و ELISA النتائج تشير إلى إزالة ناجحة من التصحيح caecal.
هذا الإجراء يمكن أن تسهم في خفض كبير من خلايا البلازما IgA محددة, تغيير واضح من IgA الإفرازية في الأمعاء الغليزية, مقارنة مع 3٪ DSS, التي لديها معدل وفيات عالية وتغير كبير في الوزن بسبب البراز الدموي الشديد, الشرج التدلى, والبطن abces. و 2٪ DSS مناسبة للعملية برمتها لمعدل البقاء على قيد الحياة عالية إلى ما يقرب من 80٪ وتغيير الوزن المعقول في كل من الصورية ومجموعات استئصال الزائدة الدودية. كما هو موضح في هذه الصور، قمنا بنجاح بتسبّب أورام القولون المرتبطة بالتهاب القولون.
في صور تلطيخ H&E، يشير السهم الأسود إلى القرحة المخاطية، ويشير رأس السهم إلى الورم الغدي، ويشير السهم الأبيض إلى تسلل العدلات بين الغدد. يمكن رؤية مراحل مختلفة من غدية في كل من الصورية ومجموعات استئصال الزائدة الدودية. يمكن استخدام هذا النموذج الزائدي المورين فعالة من حيث التكلفة للإجابة على بعض الأسئلة الهامة مثل: ما هو دور التذييل في تنظيم بكتيريا الأمعاء وكيف يشارك في الاستجابة المناعية في الأنسجة اللمفاوية المرتبطة الأمعاء.
تذكر، لتجنب الضرر في التصاق الأمعاء، قبل موقع caecum وشق الجلد الصغيرة مهمة. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا 2٪ DSS للحث على التهاب القولون. ولكن يمكن استخدام تركيز أعلى من DSS لسلالات الفئران الأخرى.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول إجراءً جراحياً مباشراً لاستئصال الزائدة الدودية في الفئران، وهو ما يُعرف بـ "الرقعة الأعورية" (caecal patch). يسهل نموذج استئصال الزائدة الدودية لدى الفئران هذا دراسة الدور البيولوجي للزائدة في تطور أمراض الجهاز الهضمي لدى البشر.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علوم الأعصاب
- أمراض الجهاز الهضمي
- علم الأورام
خلفية علمية
- لا تزال وظيفة الزائدة الدودية البشرية محل نقاش بين العلماء.
- تشير الأبحاث الحديثة إلى أن الزائدة الدودية قد تساهم في صحة الأمعاء.
- يعد فهم دور الزائدة الدودية في المرض أمراً حيوياً للنهوض بأبحاث الجهاز الهضمي.
- يعتبر إنشاء نموذج لاستئصال الزائدة الدودية المرتبط بمرض ما أمراً أساسياً لهذه الدراسات.
الغرض من الدراسة
- التحقق من الوظائف البيولوجية للزائدة الدودية.
- استكشاف العلاقة بين استئصال الزائدة الدودية وإمراضية أمراض الجهاز الهضمي.
- توفير نموذج لدراسة سرطان القولون والمستقيم المرتبط بمرض التهاب الأمعاء.
الطرق المستخدمة
- الإزالة الجراحية للرقعة الأعورية في الفئران.
- تحفيز سرطان القولون والمستقيم المرتبط بداء الأمعاء الالتهابي.
- استخدام نموذج فأري للأبحاث البيولوجية.
- تقييم دور الزائدة الدودية في تطور المرض.
النتائج الرئيسية
- يوضح البروتوكول بنجاح التقنيات الجراحية الآمنة.
- تأسيس نموذج لدراسة دور الزائدة الدودية في المرض.
- رؤى حول الآلية المرضية لأمراض الجهاز الهضمي.
- تداعيات محتملة لفهم صحة الجهاز الهضمي البشري.
الاستنتاجات
- يُعد نموذج استئصال الزائدة الدودية أداة قيمة للبحث العلمي.
- يمكن للدراسات الإضافية أن توضح دور الزائدة الدودية في حالتي الصحة والمرض.
- قد يؤدي هذا البحث إلى تحسين فهم آليات سرطان القولون والمستقيم.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح نموذج استئصال الزائدة الدودية لدى الفئران إجراء استقصاء ميكانيكي لدور الزائدة الدودية في التنظيم المناعي للأمعاء وتوازن الميكروبات (microbiota homeostasis)، مما يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لدراسة إمراض سرطان القولون والمستقيم. ومن خلال ربط استئصال الزائدة الدودية بتطور الأورام المرتبطة بالتهاب القولون، يدعم هذا النموذج التحقق من الأهداف وتقليل مخاطر الفرضيات التي تربط الأنسجة اللمفاوية بتكون الأورام. كما يوفر هذا النموذج قبل السريري قيمة تنبؤية لتقييم التدخلات العلاجية التي تستهدف المسارات المناعية المرتبطة بالأمعاء في خطوط تطوير أدوية الأورام.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يستقصي الفرضية العلاجية التي تشير إلى أن الزائدة الدودية تنظم الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأمعاء والاستجابات المناعية ذات الصلة بتطور سرطان القولون والمستقيم.
- القيمة التشغيلية: يوفر نموذجاً جراحياً قابلاً للتكرار لتقييم التغيرات في خلايا البلازما IgA+ وIgA الإفرازي كعلامات حيوية لوظيفة المناعة المعوية.
- القيمة التنبؤية: يتيح تقييم كيفية تأثير استئصال الزائدة الدودية على بدء الورم وتطوره في سياق السرطان المرتبط بالتهاب القولون.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج نموذج مرضي معياري بنقاط نهاية نسيجية قابلة للقياس تشمل تقرح المخاطية، وتسلل الخلايا المتعادلة، وتحديد مراحل الغدية السرطانية.
- القيمة التشغيلية: دعم جاهزية المقايسة من خلال الحث المتسق للأورام المرتبطة بالتهاب القولون باستخدام DSS وAOM، مما يسمح بفحص المركبات في بيئة مجهرية التهابية مضبوطة.
- القيمة الانتقالية: تسهيل جهود تأهيل المؤشرات الحيوية من خلال ربط التغيرات المناعية (مثل انخفاض IgA) بشدة المرض من الناحية التشريحية المرضية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يمثل التسلسل المستمر من الاختلال المناعي إلى تكون الأورام، مما يسمح بدراسة المحفزات الالتهابية في سرطان القولون والمستقيم.
- القيمة التشغيلية: يظهر معدل بقاء مرتفع (~80%) وأدنى حد من فقدان الوزن، مما يدعم تصميمات الدراسات الطولية وأنظمة الجرعات المتكررة.
- تخفيف المخاطر: يتيح تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال عزل متغير استئصال الزائدة الدودية في خلفية جينية محددة (C57BL/6) لتقييم تأثيرها على نفاذية المرض.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يتناسب هذا النموذج مع تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الواعدة، وصولاً إلى اختبارات الفعالية قبل السريرية، ولا سيما بالنسبة للعوامل المعدلة للمناعة أو المعدلة للميكروبيوم.
- بيولوجيا الاكتشاف: تختبر الفرضيات المتعلقة بدور الزائدة الدودية في التنظيم المناعي للأمعاء والتوازن الميكروبي باستخدام مخرجات مناعية وهستوباثولوجية قابلة للقياس.
- المسح: توفر نموذجاً معيّراً وقابلاً للاستحثاث للسرطان المرتبط بالتهاب القولون، وهو نموذج مناسب لتقييم المرشحات العلاجية في سياق ذي صلة بالفسيولوجيا المرضية.
- التحليلات: تقدم قراءات كمية ونوعية تشمل قياس التدفق الخلوي لخلايا +IgA، واختبار ELISA لـ IgA الإفرازي، والفحص النسيجي لدرجة الورم والالتهاب.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال نمذجة تسلسل مرضي ذي صلة بالبشر (من الالتهاب إلى السرطان) في نظام قابل للتعديل وراثياً.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة التفاعلات بين المناعة والأورام في الجهاز الهضمي عبر مجالات علاجية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة في الهدف من خلال ربط تدخل تشريحي محدد (إزالة رقعة الأعور) بنتائج مناعية وأورامية قابلة للقياس.
- القيمة التشغيلية: تقدم إجراءً جراحياً موحداً وقابلاً للتوسع مع معايير واضحة للمراقبة بعد الجراحة لضمان إمكانية تكرار النموذج في مواقع مختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال توفير رؤى ميكانيكية حول تعزيز الورم أو تثبيطه بوساطة مناعية.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات للمرشحات المعدلة للمناعة بناءً على المخاطر من خلال التحقق من النشاط البيولوجي ذي الصلة بالمرض في بيئة قبل سريرية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات الجراحة الفئرانية، بما في ذلك ربط الأوعية الدموية والتعامل مع الأمعاء لمنع حدوث مضاعفات ما بعد الجراحة.
- يعتمد على أدوات جراحية معقمة، وخيوط جراحية (8-0 و 4-0)، ومطهرات (entoiodine، وكحول)، ومسكنات للألم لما بعد الجراحة (buprenorphine).
- يستلزم بروتوكولات موحدة للرعاية ما بعد الجراحة، بما في ذلك الدعم الحراري ومراقبة الألم لمدة ثلاثة أيام لضمان صلاحية النموذج.
- يتطلب تركيزاً دقيقاً من DSS بنسبة (2%) وجرعة AOM بمقدار (0.01 mL/g) لتحقيق تكوين أورام متسق مرتبط بالتهاب القولون دون حدوث وفيات مفرطة.
- قد تختلف قابلية تطبيق النموذج عبر سلالات الفئران نظراً للاختلافات في الحساسية تجاه DSS، مما يستدعي تحسيناً خاصاً بكل سلالة.
