إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي
فبراير 19, 2020
تقدم هذه المقالة أساليب إعداد العينة لطريقة تحليلية فريدة في الوقت الحقيقي استنادًا إلى قياس الطيف الكتلي المحيط. هذه الطريقة تتيح لنا إجراء تحليل في الوقت الحقيقي للجزيئات البيولوجية في الجسم الحي دون أي علاجات مسبقة خاصة.
لذلك، هذا هو فريدة من نوعها القياس الطيفي الكتلة المحيطة، ومناسبة بشكل خاص لتحليل العينات البيولوجية، سواء في المختبر وفي الجسم الحي. وبما أن هذا لا يتطلب بشكل منتظم معالجة مسبقة خاصة للعينات، مثل فرز الخلايا، والتجزئة، والتركيز، فإنه يمكن تحليل عينة مع الحد الأدنى من فقدان المكونات البيولوجية، وخاصة تلك الموجودة كميّة صغيرة جداً. هذه التقنية تسمح لك بتحليل مواد الأنسجة الخام مباشرة في دقيقة واحدة بواسطة قياس الطيف الشامل.
سرعة هو دون عوائق في متانة النظام، والمزايا الرئيسية الكامنة في هذه التقنية. كل ما عليك القيام به هو فقط لإعداد السيليكا، 10 ملليغرام من عينة الأنسجة، و 10 ميكرولترات من الانتشار. ووضعها في خرطوشة يمكن التخلص منها.
يتم تعيينها إلى الجهاز PESI-MS، وسوف تحصل على النتيجة في بضع دقائق. عن طريق اختيار الطيف الشامل المناسب، يمكنك التعليق على الهوية الجزيئية. للبدء، استرداد أنسجة الكبد أو الكلى من الفريزر.
على لوحة الفلين، وقطع عينة الأنسجة إلى ما يقرب من اثنين من اثنين في اثنين من ملليمترين باستخدام مشرط أو سكين. بدلا من ذلك، لكمة خارج العينة مع تريبان وتقليم طول العمود إلى مليمترين. إذا كانت الأنسجة ملوثة بالدم، اغسل لفترة وجيزة مع محلول ملحي بارد الفوسفات.
مكان ما يقرب من 10 ملليغرام من قطع أو لكمات خارج عينة في microtube البلاستيك وإضافة 100 ميكرولترات من 50٪ الإيثانول. استخدام ميكروبستل لتجانس العينة. ثم مع pipetman، مكان 10 ميكرولترات من التجانس في بئر خرطوشة مطياف الكتلة.
ضع الخراطيش في غرفة التأين في مطياف كتلة التأين المجس المباشر المسبار وتثبيت مسبار إبرة سرقة غير القابل للصدأ التي سيتم استخدامها لعينة التأين. أغلق غطاء الغرفة بإحكام لتنشيط جهاز الأمان تلقائيًا. بدء تشغيل الكمبيوتر على متن عن طريق النقر على أيقونة بدء لتحليل، وذلك باستخدام لوحات على الشاشة، وتطبيق الجهد من 2.3 كيلوفولت إلى الإبرة لتوليد أقطاب كهربائية وضمان أن تردد الإبرة هو ثلاثة هيرتز.
انتظر 30 ثانية حتى يكتمل القياس. بعد قياس كل عينة، تخلص من الخراطيش والإبرة في متخلصات متخلصات مُهترَبٍ حيوي. لتحليل أطياف الكتلة، افتح البرنامج المرتبط بمطياف الكتلة.
انقر على ملف L-C-D في إطار متصفح ملف البيانات للبرنامج. اختيار انقر فوق على ذروة واحدة من نافذة الطيف الشامل، وتصوير تلقائيا E-I-C. تحقق من T-I-C و E-I-C، وانقر على رمز متوسط الطيف لتحديد نطاق الإطار الزمني لتوليد الطيف الشامل.
تصدير بيانات النص الطيفي الشامل. لتحليل سوائل الجسم، قم برسم ما يصل إلى 10 ميكرولترات من عينة المصل، وصرفها في أنبوب صغير 1.5 ملليلتر. إضافة 190 ميكرولترات من 50٪ الإيثانول إلى الأنبوب، ثم دوامة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
للقضاء على جميع خلايا الدم الحمراء، الطرد المركزي السائل في 15،000 مرات G لمدة دقيقة واحدة إلى خمس دقائق في أربع درجات مئوية. نقل 10 ميكرولترات من عظمى في بئر خرطوشة والمضي قدما لقياس على مطياف الكتلة كما كان سابقا. يُظهر هذا البروتوكول إعداد العينة لـ PESI-MS على عينة صلبة وعينة سائلة وحية.
سرطان الخلايا الكلوية البشرية يظهر قمم مميزة من الدهون محايدة. كانت هناك قمم قوية نسبيا في الأطياف بنسبة الشامل إلى تهمة من 900 من أنسجة سرطان الخلايا الكلوية البشرية التي لم يتم تحديدها في الأنسجة غير السرطانية المحيطة بها. هذه القمم تمثل أساسا ترياكيل الجلسرين.
مثال على البيانات المكتسبة في أنسجة الكبد العادية، يصور آفة الورم النية من مريض مصاب بالتهاب الكبد المزمن وتليف الكبد. تم تحليل مصل الإنسان من ثلاثة أفراد باستخدام PESI-MS ، كانت هناك اختلافات واضحة في الأنماط الطيفية بين الأفراد. للتغيرات الأيضية في 5-FdU حقن intraveneously في ذيل السفينة من الماوس، تم تحقيق الكشف السريع جدا وحساسة من 5-FdU مع أدوكت الصوديوم في الكبد في الموقع.
كما عمق طرف إبرة من موقع الأنسجة، يلعب أهم دور في التأين الذي يقرأ الحصول على البيانات الناجحة، تأكد من اتباع التعليمات. يمكنك تحديد الأنواع الجزيئية من خلال النظر في قاعدة البيانات التجارية. هذه هي وسيلة لتأهيل الآلية الجزيئية للمرض.
وقد أصبح العديد من الباحثين المهتمين في تطبيق هذه التقنية للتنبؤ بازدهار المرض والتكهن. خصوصاً باستخدام خزعة ريكت فقط تأكد من عدم وخز من قبل إبرة التحقيق.
ويمكن تجنب ذلك ببساطة مع أداة محددة لإزالة إبرة من الجهاز.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة فريدة من نوعها لمطيافية الكتلة المحيطية للتحليل الفوري للعينات البيولوجية في الجسم الحي. تتيح هذه التقنية تحليل مواد الأنسجة الخام دون الحاجة إلى معالجات مسبقة خاصة، مما يقلل من فقدان المكونات البيولوجية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- مطيافية الكتلة
- التحليل البيولوجي
- الكيمياء التحليلية
خلفية علمية
- يعد مطياف الكتلة المحيطي مناسباً للتحليلين المختبري والحيوى.
- لا تتطلب هذه الطريقة معالجة مسبقة مكثفة للعينات.
- تتيح هذه التقنية تحليل العينات مع تقليل فقد المكونات البيولوجية إلى أدنى حد.
- يعد التحليل السريع ميزة أساسية لهذه التقنية.
الغرض من الدراسة
- تقديم طريقة للتحليل في الوقت الحقيقي للجزيئات البيولوجية.
- إثبات كفاءة تحليل مواد الأنسجة الخام.
- تسليط الضوء على مزايا استخدام مطيافية الكتلة في الوسط المحيط.
الطرق المستخدمة
- تحضير عينات السيليكا والأنسجة.
- استخدام خراطيش تستخدم لمرة واحدة لتحليل العينات.
- التحليل المباشر للعينات البيولوجية عن طريق مطيافية الكتلة.
- المعالجة السريعة للعينات في غضون دقيقة واحدة.
النتائج الرئيسية
- تتيح هذه الطريقة إجراء تحليل سريع دون فقدان كبير للمكونات.
- تتميز بفعاليتها في تحليل العينات التي تحتوي على كميات ضئيلة جداً من المواد البيولوجية.
- تظهر متانة وموثوقية في التحليل في الوقت الحقيقي.
- تسهل دراسة الجزيئات البيولوجية في حالتها الطبيعية.
الاستنتاجات
- يعد مطياف الكتلة في الظروف المحيطة أداة قيمة للتحليل البيولوجي.
- تعزز هذه التقنية فهم العمليات البيولوجية.
- توفر هذه التقنية طريقة سريعة وفعالة للتحليل في الوقت الفعلي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح تقنية مطيافية الكتلة بالتأين بالترذيذ الكهربائي المسباري (PESI-MS) التحليل الجزيئي في الوقت الفعلي للعينات البيولوجية مع الحد الأدنى من المعالجة المسبقة، مما يدعم التحقق السريع من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. تتطلب هذه التقنية 10 mg فقط من الأنسجة أو 10 µL من المصل، مما يجعلها مناسبة للعينات قبل السريرية ذات الحجم المنخفض ويقلل من فقدان المكونات البيولوجية. وتعزز هذه القدرة من الثقة التنبؤية في تحديد المركبات الرائدة من خلال توفير بيانات مباشرة في الموقع حول ديناميكيات المستقلبات والأدوية من الأنظمة الحية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال الكشف عن الدهون المتعادلة والمستقلبات مباشرة من الأنسجة الصلبة مثل سرطان الخلايا الكلوية.
- القيمة التشغيلية: تتطلب حداً أدنى من تحضير العينة — مجرد تجانس الأنسجة في ethanol بنسبة 50% — مما يقلل من تعقيد سير العمل والتباين.
- القيمة التنبؤية: تدعم تأهيل الآليات الجزيئية عبر المطابقة مع قواعد البيانات التجارية، مما يساعد في تقييم الثقة في الأهداف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يسمح بالتحليل المباشر لمصل الدم البشري بعد ترسيب بسيط بالإيثانول والطرد المركزي، مما يتيح فحص المؤشرات الحيوية القائمة على السوائل.
- القيمة التشغيلية: يستخدم خراطيش قابلة للتخلص ومجسات من الفولاذ المقاوم للصدأ، مما يضمن التوحيد القياسي ويقلل من مخاطر التلوث الخلطي.
- القابلية للتوسع: يسهل الدوران السريع للعينات — حيث تظهر النتائج في غضون دقائق قليلة — مما يدعم الجاهزية للفحص عالي الإنتاجية.
الأبحاث الترجمية وقبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تتيح تتبع الديناميكيات في الوقت الفعلي للمستقلبات أو الأدوية في أعضاء محددة من الحيوانات الحية، مثل الكشف عن 5-FdU في كبد الفئران.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: توفر بيانات جزيئية في الموقع دون تدمير الأنسجة، مما يحافظ على السياق الفسيولوجي لتحسين الانتقال من المرحلة قبل السريرية إلى المرحلة السريرية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تكتشف الأنماط الطيفية المرتبطة بالأمراض (مثل الآفات الورمية في الكبد التليفي) لتوجيه قرارات المتابعة أو الإيقاف.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج تقنية PESI-MS ضمن سلسلة الاكتشافات الممتدة من البيولوجيا الأولية إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث توفر قراءات جزيئية كمية وسريعة تدعم اختبار الفرضيات وجاهزية المقايسات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال الكشف عن البصمات الجزيئية الخاصة بالأنسجة (مثل triacyl glycerol في الكارسينوما) دون الحاجة إلى التجزئة.
- المسح: تتيح تحليل السوائل والأنسجة الجاهزة للمقايسة عبر إدخال العينات باستخدام خراطيش قياسية.
- التحليلات: تولد بيانات طيف الكتلة (قمم m/z، وEIC، وTIC) لإجراء مقارنة كمية عبر الظروف والأفراد.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بالتحقق قبل السريري من خلال مراقبة نواتج أيض الأدوية في الجسم الحي، مثل 5-FdU الوريدي في وريد ذيل الفأر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تستخدم أجهزة قابلة لإعادة الاستخدام (المسبار، الغرفة) مع مستهلكات مخصصة للاستخدام مرة واحدة، مما يتيح التوحيد القياسي عبر المشاريع المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال توفير بيانات جزيئية مباشرة من أنظمة بيولوجية سليمة.
- القيمة التشغيلية: يضمن قابلية التكرار من خلال توحيد تحضير العينات (10 mg من الأنسجة، 10 µL من المصل، 50% إيثانول) وإعدادات ثابتة للجهد والتردد (2.3 kV، 3 Hz).
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف السريع عن المستقلبات/الأدوية في نماذج الأمراض.
- تأثير المحفظة: يدعم ترتيب الأولويات المعدل حسب المخاطر عبر الكشف عن القمم الخاصة بالمرض (على سبيل المثال، m/z 900 في الكارسينوما) والتي تغيب في العينات الضابطة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشغيل مطياف الكتلة، بما في ذلك تحضير المذيب (50% ethanol) واستخدام جهاز الطرد المركزي لمعالجة المصل.
- يتطلب وجود مطياف كتلة يعمل بالتأين عبر المسبار المباشر مع نظام خرطوشة متوافق ومسبار إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
- يستلزم توحيد معايير التعامل مع العينات بين الفرق — بما في ذلك تقطيع الأنسجة، والتجانس، ونقل السائل الطافي — لضمان اتساق البيانات.
- يجب مراعاة عمق طرف الإبرة كمتغير حرج يؤثر على كفاءة التأين وجودة البيانات في التطبيقات الحيوية داخل الجسم (in vivo).
- يقتصر على العينات المتوافقة مع التأين المحيط؛ وقد تتطلب تأثيرات المصفوفة تحسيناً في حالة السوائل الحيوية المعقدة.
