Name: الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: اكتشف بروتوكولاً لتحديد 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وأنسجة دماغ الفئران باستخدام التلطيخ المناعي والتنقيط. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة دور 5hmC في تنظيم الجينات والاضطرابات العصبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم دعم XL جزئيا من قبل البرنامج الوطني لالبحث والتطوير مفتاح الصين (2017YFE0196600)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 31771395، 31571518). تم دعم Q.S. من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFC1001703) وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة تشجيانغ (2017C03009). تم دعم W.X. من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LY18H020002) وقسم التكنولوجيا العلمية في مقاطعة تشجيانغ (2017C37057).

وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة تشجيانغ على جميع الإجراءات الحيوانية.
1. ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الكبار والخلايا العصبية
<ol><li>عزل الخلايا الجذعية العصبية الكبار من الدماغ الأمامي للبالغين (8-10 أسبوع من العمر) C57/BL6 الماوس الذكور كما هو موضح سابقا31،32.</li>
	<li>ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الكبار في DMEM / F-12 المتوسطة التي تحتوي على 20 نانوغرام / مل FGF-2، 20 نانوغرام / مل EGF، 2٪ B27 الملحق، 1٪ مضاد للمضادات الحيوية المضادة للميتيكونتيك، و 2 مل L-الجلوتامين في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية. حث على التمييز بين الخلايا الجذعية العصبية الكبار مع 1 μM حمض الريتينويك و 5 ميكرومتر فورسكولين لمدة 48 ح كما هو موضح سابقا31،32.</li>
	<li>عزل الخلايا العصبية من اليوم الجنيني 17 (E17) hippocampi من الماوس والثقافة مع المتوسطة العصبية التي تحتوي على 0.25٪ L-الجلوتامين، 0.125٪ الجلوتاماكس و 2٪ B27 الملحق في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية كما سبق وصفها33.</li>
</ol>2. التسريب عبر القلب من الماوس
<ol><li>إعداد 10٪ من هيدرات الكلورال، 4٪ بارافورمالهايد (PFA) والفوسفات المخزنة المالحة (PBS) قبل يوم واحد من التجربة، وتخزينها في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>التخدير ذكر أو أنثى بالغ C57 BL/6J الماوس مع 10٪ من الهيدرات الكلورال (50 ملغ / كغ، i.p.)، وضمان أن الحيوان هو التخدير العميق عن طريق التحقق من رد فعل الجسم. إصلاح كل طرف مع الشريط لزجة على لوحة من البلاستيك (في موقف الوجه المتابعة).</li>
	<li>قطع الجلد ثم العضلات مع مقص الجراحة. فتح تجويف الصدر مع مقص الجراحية. كشف القلب وقطع جزء صغير من الأذين الأيمن مع مقص الجراحية غرامة.</li>
	<li>Perfuse الماوس مع حقنة معقمة المتاح 10 مل من البطين الأيسر مع PBS الباردة (حوالي 30 مل لكل فأر بالغ).</li>
	<li>Perfuse الماوس مع 4٪ PFA (حوالي 30 مل في 10 دقيقة لكل الفئران الكبار) حتى يكون قاسية.</li>
	<li>فتح جمجمة الماوس مع ملقط العظام. إزالة الدماغ ووضعها في 5 مل من 4٪ PFA في أنبوب الطرد المركزي 15 مل لتثبيت ما بعد في 4 درجة مئوية. ملاحظة: تنظيف المنطقة الجراحية بعد انتهاء الجراحة.</li>
	<li>على الأقل 24 ساعة في وقت لاحق، نقل عينات الدماغ إلى محلول السكروز 30٪ للجفاف الكامل في 4 درجة مئوية.</li>
</ol>3. قسم الدماغ
<ol><li>تضمين عينات الدماغ في مجمع درجة الحرارة القطع الأمثل (أكتوبر) في حاوية صغيرة، وتهدئة في -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.</li>
	<li>قسم عينات الدماغ في سمك 20-40 ميكروم مع ميكروتومي cryostat.</li>
	<li>جمع المقاطع في PBS وتخزينها في 4 درجة مئوية.</li>
</ol>4. تلطيخ الفلورة المناعية
<ol><li>التقاط المقاطع مع مناطق الدماغ المستهدفة ووضعها في لوحة 24 جيدا مع PBS. للخلايا المستزرعة على غطاء، انتقل مباشرة إلى الخطوة 4.2.</li>
	<li>غسل مع PBS على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.</li>
	<li>إزالة PBS، وعلاج مع محمّى مسبقا 1 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. ملاحظة: إعداد 1 M حمض الهيدروكلوريك عن طريق إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك (36-38٪) إلى 10 مل من الماء في غطاء محرك السيارة الكيميائية. سخني 1 م حمض الهيدروكلوريك في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.</li>
	<li>غسل العينات مع PBS لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>كتل عينات مع PBS تحتوي على 3٪ مصل الماعز العادي و 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>حضانة أقسام مع الأجسام المضادة الأولية محددة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر. ملاحظة: استخدم الأجسام المضادة الأولية التالية: الأجسام المضادة للأرانب متعدد الكلونات المضادة للهيدروكسي ميثيل سيتوسين (1:5,000)، الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للنيوين (1:500).</li>
	<li>إخراج العينات، وحضانة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>اغسل العينات مع PBS لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة للأجسام المضادة الأولية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر. تغطية لوحة مع الألومنيوم. ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرنب IgG (1:500)، اليكسا فلور 568 الماعز المضادة للماوس IgG (1:500). نوى مضادة للبقع مع 4′-6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI).</li>
	<li>غسل العينات مع PBS لمدة 10 دقيقة على شاكر. كرر هذا مرتين أكثر.</li>
	<li>جبل أقسام الدماغ على الشرائح، إضافة كمية مناسبة من أنتيفادي تصاعد المتوسطة (حوالي 100-150 درجة مئوية)، وتغطية مع غطاء الزجاج قسط. ختم مع طلاء الأظافر.</li>
	<li>التقاط الصور باستخدام مجهر الفلورة العادي أو المعمحور.</li>
</ol>5. عزل الحمض النووي الجينومي
<ol><li>قتل شخص بالغ من الفأر C57 BL/6J (ذكر أو أنثى) عن طريق خلع عنق الرحم وإزالة الدماغ.</li>
	<li>تشريح الحصين والقشرة والأنسجة المخيخ على طبق تبريد الجليد. طحن الأنسجة مع طاحونة الأنسجة في 1 مل من الحمض النووي اللسيد العازلة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة. إضافة 250 ميكروغرام من بروتيناز K لكل 600 ميكرولتر من الليسياد العازلة. لكريات الخلية، إضافة مباشرة العازلة lysis، proteinase K، وتخلط جيدا. ملاحظة: إعداد الحمض النووي اللليس العازلة: 5 MM EDTA، 0.2٪ SDS، 200 مل حمض الكلى في 100 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك، درجة الحموضة 8.5. غسل والأوتوكلاف طاحونة الأنسجة قبل التجربة.</li>
	<li>في اليوم الثاني، إضافة حوالي 50 ميكروغرام من RNase A لكل عينة لمدة لا تقل عن 12 ساعة في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة كمية متساوية من الفينول: الكلوروفورم: isoamyl الكحول (25:24:1) ومزيج تماما.</li>
	<li>الطرد المركزي في 20,817 × ز لمدة 15 دقيقة, وإزالة supernatant في أنبوب جديد microcentrifuge.</li>
	<li>إضافة 600 درجة مئوية من الكلوروفورم إلى supernatant لتعجيل الحمض النووي، وتخلط جيدا.</li>
	<li>الطرد المركزي في 20,817 × ز لمدة 15 دقيقة, وإزالة supernatant في أنبوب جديد آخر.</li>
	<li>أضف 500 ميكرو لتر من الإيزوبروبانول إلى الـ supernatant، واخلطها جيداً.</li>
	<li>الطرد المركزي في 20,817 × ز لمدة 15 دقيقة, وإزالة supernatant تماما.</li>
	<li>غسل هطول الأمطار مع 1 مل من الإيثانول 70٪، الطرد المركزي في 20،817 × ز لمدة 1 دقيقة، وإزالة supernatant تماما. كرر مرة واحدة.</li>
	<li>تجفيف بيليه الحمض النووي تماما.</li>
	<li>حل بيليه الحمض النووي مع العازلة تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.5) إلى التركيز السليم.</li>
</ol>6. الحمض النووي نقطة لطخة
<ol><li>إعداد الحلول: 2 M هيدروكسيد الصوديوم، تريز-حمض الهيدروكلوريك العازلة (درجة الحموضة 8.5)، 6X سيترات الصوديوم المالحة (SSC).</li>
	<li>جعل خليط عينة كما الجدول 1.</li>
	<li>عينات الحمض النووي تشوه في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتبرد على الجليد.</li>
	<li>قطع الحجم المناسب لغشاء النايلون (على سبيل المثال، Hybond-N+) وشطف مع 6X SSC.</li>
	<li>وضع الغشاء على جهاز نقطة وصمة عار والاتصال بمضخة فراغ. بقعة 6 ميكرولتر من الخليط لكل نقطة على الغشاء.</li>
	<li>يُهجن لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية، ويُسدّن غشاء العينة بالحليب الخالي من الدهون في محلول ملحي مُسْتُعْمِّي ً (TBS) لمدّة ساعة واحدة.</li>
	<li>الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية التالية: أرنب متعدد الكلونات المضادة لهيدروكسي ميثيل سيتوسين (1:5,000).</li>
	<li>في اليوم الثاني، قم باحتضان الأغشية العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة للأرنب الثانوية (1:5,000) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>اغسل يُغسل مع السل لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>تصور إشارات الكيماويات، وقياس كثافة الإشارة.</li>
</ol>

<ol><li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li>
<li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li>
<li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li>
<li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+active+DNA+demethylation%3A+mechanism%2C+function+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li>
<li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li>
<li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li>
<li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Geneticset%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li>
<li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li>
<li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer%27s+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li>
<li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905(2013).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903(2017).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li>
<li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).</li>
<li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

ولا توجد مصالح مالية متنافسة.

تلعب التعديلات الجينيّة أدوارًا أساسية أثناء نمو الدماغ والنضج والوظيفة. كعلامة مستقرة لتعديل الحمض النووي, دينامية 5-hmC يستجيب للتكيف السلوكي, النشاط العصبي, ويرتبط بشكل إيجابي مع التعبير الجيني; وبالتالي، فإنه يشارك في الوظيفة الطبيعية للدماغ والاضطراب العصبي4. لاستكشاف وظيفتها في الخلايا والأنسجة، فمن الضروري للكشف عن وجود 5-hmC ومقارنة المستوى قبل وبعد العلاج. هنا، أظهرنا طريقتين مناسبتين للكشف عن 5-hmC في الخلايا والأنسجة، والتي يمكن تنفيذها مع المعدات المشتركة في المختبر.
<p class="jove...

وقد ثبت التعديلات الجيني، بما في ذلك تعديل الحمض النووي، وتعديل الهيستون وتعديل الحمض النووي الريبي، للعب وظائف أساسية في العمليات البيولوجية المتنوعة والأمراض1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7- ولفترة طويلة، اعتُبر مثيلة الحمض النووي (أي 5-ميثيلسيتوسين (5-م.م)) علامة جينية مستقرة للغاية ولا يمكن تعديلها مرة أخرى في الجينوم. في الآونة الأخيرة، تم العثور على أن 5-mC يمكن أكسدة إلى 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين (5-hmC) من قبل TET (10-11 translocations) البروتينات العائلية بما في ذلك TET1، TET2، وTET38،9. وتظهر دراسات أخرى أن 5-hmC يمكن أن تكون بمثابة علامة مستقرة ولعب الأدوار البيولوجية من خلال تنظيم التعبير الجيني4،10،11،12.
وتشير الأدلة الحالية إلى أن 5-hmC هو المخصب للغاية في الأنسجة العصبية / الخلايا بالنسبة لأنواع أخرى من الأنسجة في الثدييات، ويعرض الميزات الديناميكية خلال تطوير الخلايا العصبية13،14. في الجهاز العصبي، 5-hmC بوساطة التعديلات الجينية تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا الجذعية العصبية، والنشاط العصبي، والتعلم والذاكرة، وتشارك في اضطرابات عصبية متعددة بما في ذلك متلازمة ريت، التوحد، الزهايمر المرض، مرض هنتنغتون، الخ2،13،15،16،17،18،19،20.
هناك العديد من النهج للكشف عن 5-hmC في الخلايا والأنسجة14،21،22،23،24. هنا، ونحن نصف طريقتين للكشف عن وجود 5-hmC وكمية المستوى العالمي من 5-hmC: تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار. هذه الطريقتين مريحة وحساسة، وقد استخدمت بنجاح في الدراسات السابقة25،26،27،28،29،30. الخطوات الرئيسية لهذين الأسلوبين هي إزالة الحمض النووي. لتلطيخ مناعة 5-hmC، مطلوب المعالجة المسبقة للعينات مع 1 M حمض الهيدروكلوريك. ل5-hmC نقطة وصمة عار، يتم تنفيذ denaturation الحمض النووي مع حل هيدروكسيد الصوديوم. هذه الطريقتين جنبا إلى جنب مع تسلسل الجيل القادم هي أدوات مفيدة جداً للتحقيق في وظيفة 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>برنامج Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 الماعز المضاد للفأر IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>مضاد ل 5-hydroxymethylcytosine</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>المضاد ل NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 الملحق</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>مكمل B27</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 مكمل</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat microtome</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12 متوسط</td><td>أوميغا Scientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو البشرة</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>فورسكولين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>جلوتاماكس</td><td>ثيرمو</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-الجلوتامين</td><td>جيبكو</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>متوسط عصبي</td><td>جيبكو</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>مختبرات ناقلات مصل الماعز العادي</td><td></td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>غشاء النايلون (Hybond & trade ؛ -N + )</td> <td>Amersham Biosciences</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>أكتوبر</td><td>لايكا</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>القلم Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25: 24: 1)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>بولي دي ليسين</td><td>سيجما</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>بروتيناز ك</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>حمض</td> <td>الريتينويكسيجما ألدريتش</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>تريتون X-100</td><td>سولاربيو</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

وقد تم تحديد تعديلات الحمض النووي متعددة في الجينوم الثدييات. ومن هذا السبب، تمت دراسة الآليات الجينية بوساطة 5-ميثيل سيتوسين و5-هيدروكسي ميثيل السيتوسين بوساطة مكثفة. 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين يعرض السمات الديناميكية أثناء النمو الجنيني وبعد الولادة في الدماغ، ويلعب وظيفة تنظيمية في التعبير الجيني، ويشارك في اضطرابات عصبية متعددة. هنا، ونحن نصف الطرق التفصيلية بما في ذلك تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين في الخلايا المستزرعة وأنسجة الدماغ من الماوس.

للكشف عن توزيع 5-hmC في الحصين من الفئران البالغة، قمنا بإجراء الفلورة المناعية مع الأجسام المضادة ضد الخلايا العصبية (NeuN) و 5-hmC. في الحصين، 5-hmC شارك في ترجمة جيدا مع علامة الخلايا العصبية NeuN(الشكل 1A-H)،مما يشير إلى إثراء 5-hmC في الخلايا العصبية.
لتحديد ديناميات 5-hmC أثناء تطوير الخلايا العصبية، تم إجراء نقطة وصمة عار لأول مرة مع عينات الحمض النووي معزولة عن تكاثر وتباين الخلايا الجذعية العصبية الكبار (NSCs). وأظهرت نتائج نقطة وصمة عار ...

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ، وذلك باستخدام تلطيخ الفلورة المناعية وطرق الحمض النووي نقطة لطخة.

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيسيلتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ باستخدام immunofluorescence، والطريقة الجديدة، ولطخة نقطة الحمض النووي. 5-hydroxymethylcytosin، أي 5hmC، تعديل اللاجينية المخفف، يلعب وظيفة هامة في تنظيم التعبير الجيني والمشاركة في اضطرابات عصبية متعددة.في الواقع، يمكن استخدام أساليبنا للكشف عن 5hmC في خلايا متعددة والأنسجة. انها مريحة ويمكن تنفيذها مع المعدات المشتركة في المختبر. تبدأ عن طريق وضع وجه الماوس حتى على لوحة من البلاستيك وتحديد كل طرف مع شريط لزجة.استخدم مقص جراحيًا لقطع الجلد والعضلات، وفتح تجويف الصدر. كشف القلب وقطع جزء صغير من الأذين الأيمن مع مقص الجراحية غرامة. باستخدام 10 ملليلتر المتاح، معقمة حقنة، ضخ الماوس من البطين الأيسر مع برنامج تلفزيوني الباردة.ثم، perfuse الماوس مع 4٪ PFA حتى أنها قاسية. ثم افتح الجمجمة بملباب العظام وأزل الدماغ. ضع الدماغ في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر مملوء بخمسة ملليلترات من 4٪ PFA واخزنه عند أربع درجات مئوية.بعد 24 ساعة، نقل الدماغ إلى محلول السكروز 30٪، وتركها في أربع درجات مئوية للجفاف الكامل. قبل القطاعات، تم تجميع الدماغ في مجمع درجة حرارة القطع الأمثل وبارد إلى ناقص 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. عينات الدماغ المقطع بسمك 20 إلى 40 ميكرومتر باستخدام ميكروتوماتية cryostat.جمع أقسام في برنامج تلفزيوني وتخزينها في أربع درجات مئوية. التقاط أقسام الدماغ من الفائدة ووضعها في لوحة 24-جيدا مع برنامج تلفزيوني. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني على شاكر لمدة 10 دقائق.إزالة برنامج تلفزيوني وعلاج مع مسخن حمض الهيدروكلوريك واحد المولر في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حمض الهيدروكلوريك هو تآكل ويرجى إعداده في عقد الكيميائية. ثم، غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ومنعها مع برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل الماعز العادي 3٪و 0.1٪ تريتون X-100.اترك العينات على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. إضافة أجسام مضادة أولية محددة إلى الأقسام واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر. في اليوم التالي، أخذ العينات وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة الأجسام المضادة الثانوية. غطي الطبق بالألمنيوم واتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أثناء الاهتزاز. بعد الحضانة، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وجبل لهم على الشرائح.إضافة 100 إلى 150 ميكرولتر من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة، وتغطية مع غطاء قسط الزجاج، وختم مع طلاء الأظافر. صور أقسام الدماغ مع مجهر منتظم أو confocal. لعزل الحمض النووي الجينومي، ابدأ بتشريح قرن آمون والقشرة وأنسجة المخيخ على طبق مبرد بالجليد.إضافة ملليلتر واحد من الحمض النووي العازلة وطحن الأنسجة. نقل العينة إلى أنبوبrifuge صغيرة نظيفة وإضافة 250 ميكروغرام من البروتينات-K لكل 600 ميكرولترات من عازلة تحلل. ثم، إضافة حوالي 50 ميكروغرام من RNase A لكل عينة واحتضان لمدة 12 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية.بعد الحضانة، إضافة حجم متساو من الكحول ايساميل الكلوروفورم الفينول وخلطها جيدا. الطرد المركزي الخليط وفقا لاتجاهات المخطوطات ونقل نابيرنت إلى أنبوب جديد. أضف 600 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى المُسَتَلَد، ويُخلط جيداً، والطرد المركزي وفقاً لاتجاهات المخطوطات.نقل سوبرناتانت إلى أنبوب جديد وإضافة 500 ميكرولترات من ايزوبروبانول. اخلطي جيداً وطاردة مركزية مرة أخرى للتعجيل بالحمض النووي. بعد الطرد المركزي، والتخلص من اهب، وغسل بيليه الحمض النووي مع 70٪ الإيثانول وفقا لاتجاهات المخطوطات.الهواء الجافة بيليه الحمض النووي تماما وبعد ذلك، حل في المخزن المؤقت تريس-HCl. قبل البدء، قم بإعداد الحلول المطلوبة وعينة الخليط وفقاً لتوجيهات المخطوطات. اِنسخ عينة الحمض النووي عن طريق تسخينها إلى 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم ضعها على الجليدقطع الحجم المناسب من غشاء النايلون وشطفه مع 6X SSC. ضع الغشاء على جهاز نقطة لطخة وربط مضخة فراغ. بقعة ست نقاط ميكروليتر على الغشاء وتهجين لمدة 30 دقيقة في 80 درجة مئوية.ثم، كتلة عينة الغشاء مع الحليب الخالي من الدهون والملوحة تريس المخزنة، أو TBS، لمدة ساعة واحدة. إضافة الأجسام المضادة الأرانب البولي كلينال المضادة 5-هيدروكسي ميثيليسيتوسين إلى الغشاء واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، ترك غشاء العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، ثم غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBS.احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة المضادة للأرانب مضادة 30 دقيقة ومن ثم، وغسل ثلاث مرات مع TBS. تصور إشارات chemiluminescence وقياسا شدتها. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين، أو 5hmc، في قرن آمون من الفئران الكبار.المناعي مع الأجسام المضادة ضد الخلايا العصبية, 5hmC يكشف أن هناك إثراء 5hmC في الخلايا العصبية. يمكن تحديد ديناميات 5hmC خلال التنمية العصبية مع اختبار نقطة لطخة من عينات الحمض النووي معزولة عن الخلايا الجذعية العصبية الكبار المتكاثرة والمتمايزة. مستويات عالمية من 5hmC زيادة كبيرة خلال التمايز ومستوى 5hmC في الخلايا العصبية أعلى مما كانت عليه في الخلايا الجذعية العصبية.الخطوة الرئيسية لهذه الطريقة هي التأكد من أن التككر الكامل لعينات الحمض النووي.

the-detection-5-hydroxymethylcytosine-neural-stem-cells-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يمكن استخدام EpiMark 5 - 5 - مؤسسة حمد الطبية وأدوات التحليل MC لتحليل وquantitate methylcytosine 5 و 5 hydroxymethylcytosine داخل موضعا cific جمعية مهندسي البترول. عدة يميز MC - 5 - 5 من مؤسسة حمد الطبية عن طريق إضافة السكر إلى مجموعة الهيدروكسيل من HMC - 5 عبر رد فعل الأنزيمية باستخدام β - ناقلة الغلوكوزيل (T4 - BGT). عند 5 - HMC يحدث في سياق CCGG ، يحول هذا التعديل MspI شطورة موقع إلى موقع غير شطورة.

الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

ووصف هو عملية وضع العلامات على مرحلتين باستخدام β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) لنقل أزيد من الغلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5، تليها الكيمياء اضغط هنا لرابط نقل البيوتين لتخصيب سهلة وكثافة مستقلة. هذه الطريقة فعالة ووضع العلامات المحددة تمكن من مؤسسة حمد الطبية تخصيب-5 مع خلفية منخفضة للغاية وعالية الإنتاجية عن طريق رسم الخرائط epigenomic الجيل القادم التسلسل.

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

نحن هنا تصف في الجسم الحي الطفرات فحص لأعداد صغيرة من الخلايا المكونة للدم تنقيته باستخدام اسي نموذج الفأر وراثيا. الجين اسي يمكن عزل لتحديد التردد، والموقع، ونوع من المسوخ الحمض النووي نشأت عفويا أو بعد التعرض لgenotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

إدارة اثنين من النظير ثيميدين، ايدو وBrdU، في الفئران الحوامل يسمح للتحليل تطور دورة الخلية العصبية في والخلايا الاصلية في مخ الفأر الجنينية. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد آثار الإجهاد السمية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة، أثناء نمو المخ.

تقييم التقدم دورة الخلية الجذعية العصبية من الخلايا والسلف في تطوير الدماغ ماوس بعد الإجهاد السمية الوراثية

هنا نصف طريقة كيميائية مناعية حساسة لرسم خرائط التوزيع المكاني لمشتقات أكسدة 5 مللي متر مكعب بناء على استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع البيروكسيداز وتضخيم إشارة التيراميد.

الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

المكتشفة حديثا المؤكسد أشكال 5-ميثيلسيتوسيني (أوكسي-mCs)، 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) قد تمثل تعديلات الحمض النووي متميزة مع أدوار وظيفية فريدة من نوعها. هنا هو وصف سير عمل شبه كمي للتصور oxi-الإشراف على التوزيع المكاني والتنميط كثافة إشارة كولوكاليزيشن.

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

نحن نقدم طريقة فعالة واستنساخه لعزل وثقافة الخلايا العصبية السلف من الأنسجة الجنينية والولادة في الدماغ إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من هستون 3 يسين 79 ديميثيليشن (H3K79me2)--علامة هيستون تقع داخل مجال كروي من هستون 3.

عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن

والهدف من هذا التقرير وصف البروتوكول للكشف المناعي قوية من علامات جينية، 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) في تطوير وبوستميتوتيك الماوس الشبكية.

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

ميثيل الحمض النووي الريبي ميثيل المناعة المقايسة هو طريقة تعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة لإثراء لشظايا الحمض النووي الريبي الميثيل. إلى جانب التسلسل العميق ، فإنه يؤدي إلى تحديد النصوص التي تحمل تعديل M5C.

ميثيل الحمض النووي الريبي الفحص المناعي لدراسة m5C التعديل في arabidopsis

تسمح القدرة على وضع علامة دائمة على الخلايا الجذعية وذريتها باستخدام الفلوروفور باستخدام خط فأر تتبع النسب المعدلة وراثيا القابل للتحريض بإجراء تحليل مكاني وزمني للتنشيط والانتشار والهجرة و / أو التمايز في الجسم الحي. يمكن أن يكشف تتبع النسب عن معلومات جديدة حول الالتزام بالنسب ، والاستجابة للتدخل (التدخلات) ، وتعدد القدرات.

تتبع نسب الخلايا الجذعية المستحثة ذات العلامات الفلورية في دماغ الفأر البالغ

تصف هذه الورقة بروتوكولا للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة.

المراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة

اكتشف بروتوكولاً لتحديد 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وأنسجة دماغ الفئران باستخدام التلطيخ المناعي والتنقيط. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة دور 5hmC في تنظيم الجينات والاضطرابات العصبية.

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

استكشف المزيد من الفيديوهات