الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي
يناير 28, 2020
وقد مكنت تقنيات تحرير الجينات الباحثين من توليد طفرات حمار وحشي للتحقيق في وظيفة الجينات بسهولة نسبية. هنا، نقدم دليلا ً لإجراء الجينة المتوازية للجنين والقياس الكمي لإشارات التهجين في الموقع في سمك الحمار الوحشي. ويوفر هذا النهج غير المتحيز دقة أكبر في التحليلات الظاهرية القائمة على التهجين في الموقع.
وغالبا ما يتم تقييم عواقب الطفرات على التعبير الجيني نوعيا عن طريق التهجين في الموقع وسجل عموما بصريا، وهو أمر ذاتي ومتحيز من قبل توقعات الباحث. ويوفر هذا الأسلوب طريقة أكثر اتساقاً لمقارنة التجارب في الموقع عن طريق قياس كثافة الصورة وإزالة هذا التحيز. ويمكن أيضاً تكييف هذا الأمر بسهولة مع نظم نموذجية أخرى تستخدم التهجين في الموقع كقارئ للتعبير الجيني.
ابدأ بتصوير الأجنة المهجنة الموضعية أو الملطخة بـ ISH. إعداد محلول الجلسرول ومزجها لتجانس. نقل الأجنة إلى محلول الجلسرين مع ماصة باستور ثلاثة ملليلتر وتركها لتسوية لمدة خمس دقائق على الأقل.
إعداد وتسمية ما يكفي من أنابيب PCR لنقل الأجنة الملطخة ب ISH بعد التصوير، ثم استخدام ماصة باستور ثلاثة ملليلتر لإضافة 100٪ غليسيرول إلى الجزء السفلي من بئر من شريحة الاكتئاب الزجاج. نقل جنين واحد ملطخ ب ISH إلى الشريحة الزجاجية وتوجيهه تحت مجهر ستيريو مجهز بكاميرا رقمية وإضاءة أسفل وأعلى. باستخدام الجنين الأول، ضبط الإضاءة ووقت التعرض في التكبير المطلوب.
صورة أكبر عدد من الأجنة كما هو مطلوب وتسمية كل صورة مع عدد فريد. بعد التصوير، قم بنقل كل جنين إلى أنبوب PCR يحمل نفس العدد وإذا لزم الأمر قم بتكفير الجلسرين الزائد من أنابيب PCR. لاستخراج الحمض النووي، إضافة 40 إلى 75 ميكرولترات من عازلة التحلل القلوية مثل HoTSHOT إلى كل أنبوب.
احتضان الأنابيب في 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا ثم تبريدها إلى أربع درجات مئوية. إضافة حجم مساو من العازلة تحييد والمضي قدما مع genotyping لطفرة الفائدة. لإجراء تحليل الصورة، حدد الصورة وافتحها في فيجي وقم بعكسها بالنقر فوق تحرير ثم عكس، ثم قم بتحويل نوع الصورة إلى 8 بت بالنقر فوق علامة التبويب "صورة" وتحديد الكتابة وتحديد 8 بت.
حدد أداة المضلع وارسم منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار يدوياً على الصورة حول المنطقة التي تحتوي على إشارة ISH التي يجب قياسها. اضغط على T لفتح مدير ROI وحدد المنطقة التي تهمك، ثم انقر على قياس. نسخ القيمة الوسط من إطار النتائج إلى جدول بيانات.
لقياس كثافة الخلفية، قم بنقل عائد الاستثمار إلى منطقة في الجنين بدون تلطيخ وانقر على إضافة في مدير عائد الاستثمار. حدد منطقة الخلفية وانقر على قياس، ثم سجل قيمة شدة المتوسط في جدول البيانات. الحصول على متوسط كثافة البيكسل لإشارة التهجين NC2 عن طريق طرح متوسط شدة الخلفية من المنطقة الملطخة.
بعد تحديد متوسط كثافة البيكسل لكل عينة، قم بتعيين نمط جيني لكل عينة. إذا لم يتم تحديد النمط الجيني، استبعاد العينة من التحليل اللاحق. فرز متوسط قيم كثافة العينة وفقاً للنمط الجيني، ثم تابع الاختبارات الإحصائية.
وقد ثبت فائدة هذه التقنية على ISH لdnmt3bb. 1 في الأجنة من runx1 هيتروزيجوس في كروس. انخفاض في dnmt3bb.
تم الكشف عن تعبير 1 في المسوخ المتجانسة runx1 المتجانسة بينما أظهرت أجنة غير المتغايرة أي اختلافات كبيرة في dnmt3bb. 1 تعبير. عند محاولة تحديد تأثير طفرة lmo4 على التعبير runx1، لم يظهر هذا التحليل اختلافات كبيرة في التعبير بين نوع البرية وهيموزيغوس lmo4 المسوخ.
ومع ذلك، تم الكشف عن انخفاض صغير في التعبير runx1 بواسطة QPCR الجنين واحد. في حوالي 0.4٪ من الأجنة runx1 مسبار، وكان ISH خلفية عالية التي أسفرت عن عدد سلبي عندما تم طرحها من الإشارة. وفي مثل هذه الحالات، استبعدت الأجنة من التحليل.
وقد تم اختبار أربع مناطق مختلفة على الأجنة لتحسين تصحيحات الخلفية. في حين كان هناك فرق مستقر نسبيا في كثافة العائد على الاستثمار في أي من المجالات الخلفية ، R3 أظهرت دائما كثافة أعلى من العائد على الاستثمار ، وينبغي عدم استخدامها لتصحيح الخلفية. وقد ثبت أن R1 وR4 أكثر المجالات ملاءمة لتصحيح الخلفية.
من المهم العثور على أفضل الظروف للتصوير والحفاظ عليها دون تغيير طوال التجربة. نوصي أيضًا بتحديد كثافة البكسل قبل تعيين النمط الجيني لكل عينة.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لإجراء التنميط الجيني المتوازي للأجنة وقياس كمية إشارات التهجين الموضعي في أسماك الزيبرفيش. ومن خلال استخدام هذا النهج غير المنحاز، يمكن للباحثين تحقيق دقة أكبر في التحليلات المظهرية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علوم الأعصاب
- علم الوراثة
- علم الأحياء النمائي
خلفية علمية
- تسهل تقنيات تحرير الجينات توليد طفرات في سمك الزيبرا.
- يُعد التهجين الموضعي طريقة شائعة لتقييم التعبير الجيني.
- يمكن أن تؤدي طرق التقييم التقليدية إلى التحيز والذاتية.
- تهدف هذه الدراسة إلى تقديم نهج أكثر اتساقاً وكمياً.
الغرض من الدراسة
- لتحسين دقة التحليلات المظهرية في أسماك الزيبرفيش.
- لتوفير طريقة قياسية لتحديد الأنماط الجينية للأجنة.
- لقياس إشارات التهجين الموضعي كمياً وبشكل موضوعي.
الطرق المستخدمة
- تصوير الأجنة المصبوغة بتقنية التهجين الموضعي (ISH) باستخدام مجهر ستيريو.
- تحضير محاليل الجلسرول لنقل الأجنة.
- استخدام محلول التحلل القلوي لاستخلاص الـ DNA.
- استخدام برنامج Fiji لتحليل الصور والتقدير الكمي.
النتائج الرئيسية
- إثبات انخفاض في تعبير dnmt3bb.1 في الطفرات متماثلة الزيجوت لـ runx1.
- تحديد مناطق تصحيح الخلفية المناسبة لتحليل الصور.
- عدم ظهور فروق ذات دلالة إحصائية في التعبير بين النوع البري والطفرات متماثلة الزيجوت لـ lmo4.
- توفير طريقة موثوقة لتحديد الأنماط الجينية بناءً على كثافة البكسل.
الاستنتاجات
- تعزز هذه الطريقة من موثوقية تحليل التعبير الجيني.
- يمكن تكييف هذه الطريقة للاستخدام في أنظمة نماذج أخرى.
- يُعد الحفاظ على ظروف تصوير متسقة أمراً بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يقلل تحليل التهجين الموضعي الكمي من الذاتية في تقييم التعبير الجيني، مما يحسن موثوقية البيانات للتحقق من الأهداف في نماذج zebrafish. يدعم هذا النهج تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال تمكين الارتباط غير المتحيز بين النمط الجيني وأنماط التعبير المظهري. وتعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال توفير قياسات موحدة وقابلة للتكرار عبر عينات ذات أنماط جينية مختلطة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال القياس الكمي غير المنحاز لإشارات التعبير الجيني المحددة مكانياً.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل متسق لمقارنة الأنماط الظاهرية للطفرات والأنماط البرية دون تحيز من المراقب.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز مجموعة المشاريع من خلال التمييز بين التغيرات الجوهرية في التعبير الجيني والضجيج الخلفي في النماذج الجينية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يعمل على تحضير الأنظمة البيولوجية المعتمدة للفحص اللاحق للمركبات من خلال وضع ملفات تعريف التعبير الأساسية.
- إمكانية التكرار: يعمل على توحيد بروتوكولات الحصول على الصور وتحليلها لتقليل التباين بين التجارب.
- المخرجات الكمية: يُنتج بيانات قياس شدة البكسل القابلة للقياس والمناسبة للمقارنة الإحصائية بين مجموعات العلاج.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يحافظ على الاتساق بدءاً من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال استخدام قراءات نمطية ظاهرة موضوعية.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يسهل ربط التغيرات في التعبير الجيني بالحالة الجينية لتطوير مؤشرات حيوية ترجمية.
- قرارات معدلة حسب المخاطر: يتيح اتخاذ قرارات تقدم قائمة على البيانات من خلال تقليل النتائج الإيجابية الكاذبة في دراسات التحقق من الأهداف.
تكامل مسارات العمل والتدفقات
تندمج هذه الطريقة في سير عمل الاكتشاف المبكر من خلال ربط التأكيد الجيني بالتقييم المظهري الكمي، مما يدعم تحديد المركبات الرائدة عبر تقليل المخاطر الميكانيكية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال توفير بيانات كمية عن توزيع mRNA لتوضيح وظيفة الجينات في مسارات النمو.
- المسح: تتيح توحيد المقايسات من خلال ظروف تصوير وتحليل قابلة للتكرار لضمان تقييم موثوق للمركبات.
- التحليلات: توفر قياسات كمية للشدة وقيمًا مطروحة منها الخلفية، مما يتيح المقارنة الإحصائية للظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج الاكتشاف بالاستمرارية قبل السريرية من خلال ضمان تسجيل ظاهري متسق عبر الأنظمة النموذجية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتحديد الأنماط الجينية والقياس الكمي قابلة للتطبيق على جينات وخطوط طافرة متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في بيانات التعبير الجيني.
- القيمة التشغيلية: تحسين قابلية التكرار والتوسع من خلال بروتوكولات موحدة للتعامل مع الأجنة وتحليل الصور.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير بيانات موضوعية لتخصيص رأس المال في البرامج في مراحلها المبكرة.
- التأثير على المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال التمييز بين التأثيرات البيولوجية الحقيقية والتباين التقني.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع أجنة سمك الزيبرفيش، والمجاهر، وتقنيات التنميط الجيني الأساسية.
- يعتمد على المجهر الستيريو المزود بإمكانيات التصوير الرقمي وبرنامج Fiji للتحليل.
- يستلزم توحيد معايير ظروف التصوير، وأوقات التعرض، ومناطق تصحيح الخلفية بين الفرق البحثية.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع سلالات مختلفة من سمك الزيبرفيش ومراحل نمائية متنوعة.
- يشمل قيوداً عملية مثل تحسين تصحيح الخلفية واستبعاد العينات ذات الأنماط الجينية غير المحددة أو الضوضاء العالية في الخلفية.
