تحديد الطفرات من خلال ذوبان عالية الدقة في عدد السكان من الأرز الحرث
سبتمبر 2, 2019
في هذه المقالة، نقدم البروتوكول الذي يوصف بأنه تحليل ذوبان عالية الدقة (HRM) القائم على الهدف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING). تستخدم هذه الطريقة تغيرات الفلورة أثناء ذوبان الحمض النووي المزدوج وهي مناسبة لفحص الإنتاجية العالية لكل من الإدراج/الحذف (Indel) وsubstition قاعدة واحدة (SBS).
وسيكون من المفيد جدا لتكاثر الصفات التي يصعب تقنيا أو مكلفة لتحديدها، مثل مقاومة المرض، والمحتوى المعدني. انها بسيطة جدا ، فعالة من حيث التكلفة ، وعالية الإنتاجية التقنية. للبدء، ضع أربعة أقراص ورقة في كل بئر من لوحة PCR 96-well.
إضافة 50 ملليلتر من حل عازلة A في كل بئر. تجميد لوحة في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، إلغاء تجميد لوحة في درجة حرارة الغرفة.
احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إضافة 50 ميكرولترات من المخزن المؤقت B إلى كل بئر، ويخلط جيدا من قبل دوامة. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة دقيقة واحدة في 1، 500 مرات ز.
جمع المابير كما DNA لPCR. أولاً، استخدم الحمض النووي الفائق من نموذج PCR لتحسين درجة حرارة الدنال. إضافة الكواشف وميكر واحد من الحمض النووي الفائق في كل PCR جيدا.
ضع أنابيب PCR في كتلة حرارية قابلة للتدرج، واضبط برنامج التدفئة وفقًا للمخطوطة لتحديد درجة حرارة الوَجَر المثلى لكل جزء مستهدف. تنفيذ الكهرباء للمنتج PCR على 1٪ agarose هلام لفحص amplicons. تحديد درجة حرارة القطع المثلى التي تمكن من تضخيم محدد للجزئة المستهدفة.
لإجراء تحليل HRM، والجمع بين الكواشف، بما في ذلك ميكرولتر واحد من صبغة الفلورانس 10 مرات وميكر واحد من ناظر الحمض النووي في كل بئر من لوحات HRM المتوافقة. في كل لوحة، وتشمل عينة واحدة من نوع البرية الأبوة والأمومة واحد السيطرة السلبية دون الحمض النووي. إضافة قطرة من الزيوت المعدنية إلى كل بئر لمنع التبخر.
ثم، ختم لوحة مع فيلم لاصق، والطرد المركزي في 1،000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة. تشغيل PCR باستخدام درجة حرارة الحناء الأمثل. الآن، إزالة الفيلم لاصق من لوحة، وإدراج لوحة في آلة إدارة الموارد البشرية.
في البرنامج، حدد تشغيل جديد من قائمة الملفات، أو اضغط على الزر تشغيل في أعلى الشاشة. حدد درجات حرارة البداية والنهاية للذوبان من 55 إلى 95 درجة مئوية. حدد عينات لتحليل ذوبان عالية الدقة، واستبعاد عينات مشابهة لتحكم سالب.
تطبيع منحنيات ذوبان أن يكون لها نفس بداية وتنتهي fluorescence. يؤكد بصرياً أن مؤشرات درجة الحرارة القصوى الأدنى والأدنى هي في منطقة من المنحنيات. الحفاظ على دلتا F، الفرق من الفلوريسنس، مستوى في الإعداد الافتراضي من 05.
من قائمة تحديد المقاييس، حدد المتغير المشترك مقابل، واختر الحساسية العادية. حدد H12 لاستخدام النوع البرية كتحكم. وتعتبر العينات ذات قيمة دلتا F أكبر من 05 تحتوي على نبات متحول.
ثم، باستخدام طريقة CTAB، استخراج الحمض النووي من كل من النباتات الأربعة من بركة متحولة مع منحنى ذوبان مختلفة كثيرا عن نوع البرية. بعد القياس الكمي باستخدام مقياس الطيف، ضبط الحمض النووي مع NanoDrop 2000 إلى تركيز نهائي من حوالي 25 نانوغرام لكل ميكرولتر. إضافة 0.4 microliters من التمهيدي PCR في عينة الحمض النووي في أنابيب PCR، ووضعها في دورة حرارية، وضبط البرنامج لتضخيم جزء الهدف.
ثم، إرسال منتجات PCR إلى شركة لتسلسل. بعد تسلسل سانجر، قارن الآفة الجزيئية من خلال مقارنة التسلسلات بين مصنع M2 والنوع البري. في هذه الدراسة، أظهر مسح وتحليل شتلات M2 للطفرات في جينات OsLCT1 أو SPDT أن معظم العينات كانت لها منحنيات ذوبان لا تختلف بشكل كبير عن النوع البري مع دلتا F أقل من 05.
وأظهرت المسوخ منحنيات إدارة الموارد البشرية مختلفة بشكل كبير مع دلتا FS أكبر من 05 في درجات حرارة من 90 إلى 92 درجة مئوية و 81.5 إلى 83.5 درجة مئوية، على التوالي. تم تأكيد نوع الطفرة والموضع على الجينات من 4, 560 M2 الشتلات من قبل الكروماتوجات التسلسل. تم تحديد موقع heterozygous مع طفرة من G إلى A في 4، 304 أزواج قاعدة من OsLCT1.
واحدة من النيوكليوتيدات واحد ظهرت في 4، 240 أزواج قاعدة OsLCT1، ولوحظ حذف ثلاثي نوكليوتيد TTC في موقف 5، 948 إلى 5، 950 أزواج قاعدة SPDT. أنا أمثل PCR قبل تحليل الموارد البشرية. الصبغة في الجل هو قليلا الضارة.
تذكر أن تضع على قفازات عند تشغيل هلام.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تُقدم هذه المقالة بروتوكولاً لعملية تتبع الطفرات المستحثة في الجينومات (TILLING) القائمة على تحليل الانصهار عالي الدقة (HRM). وتعد هذه الطريقة فعالة للفحص عالي الإنتاجية لطفرات الإدخال/الحذف (Indel) وطفرات استبدال القاعدة الواحدة (SBS).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الجينوم
- تربية النبات
- البيولوجيا الجزيئية
خلفية علمية
- يُعد تحليل الانصهار عالي الدقة تقنية تُستخدم للكشف عن التباينات الجينية.
- يتيح نظام TILLING تحديد الطفرات بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
- تعتبر هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للصفات التي يصعب تقييمها.
- يمكن تطبيق هذه التقنية في مجالات متنوعة، بما في ذلك الزراعة وعلم الوراثة.
الغرض من الدراسة
- تقديم بروتوكول لاستخدام تحليل ذوبان عالي الدقة (HRM) في تقنية TILLING.
- تسهيل الفحص عالي الإنتاجية للتغيرات الجينية.
- تحسين كفاءة تحديد الطفرات المرتبطة بالسمات الهامة.
الطرق المستخدمة
- تجهيز أقراص الأوراق في طبق PCR ذي 96 بئرًا.
- إضافة محلول المنظم A إلى كل بئر.
- تجميد وإذابة طبق PCR لتحضير العينات.
- مراقبة تغيرات الفلورة أثناء انصهار DNA.
النتائج الرئيسية
- يتيح هذا البروتوكول الكشف الفعال عن الطفرات من نوع Indels و SBS.
- تعزز قدرة الإنتاجية العالية من كفاءة الفحص.
- طريقة فعالة من حيث التكلفة ومناسبة لمختلف التطبيقات البحثية.
- تسهل عمليات التربية لسمات مثل مقاومة الأمراض.
الاستنتاجات
- تُعد تقنية TILLING القائمة على HRM أداة قيمة في الأبحاث الوراثية.
- تُبسط هذه الطريقة عملية تحديد الطفرات.
- يمكنها أن تساعد بشكل كبير في تطوير أصناف نباتية محسنة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح تقنية TILLING القائمة على تحليل الانصهار عالي الدقة (HRM) الكشف عالي الإنتاجية ومنخفض التكلفة عن كل من استبدالات القواعد المفردة وطفرات الإدخال/الحذف في جينومات النباتات. ويدعم هذا النهج مرحلة التحقق المبكر من الأهداف من خلال توفير بيانات كمية لفحص الطفرات، مما يوجه قرارات التربية للسمات المعقدة مثل مقاومة الأمراض والمحتوى الغذائي. كما أن دمج هذه التقنية مع استخلاص الحمض النووي البسيط يعمل على تحسين كفاءة سير العمل في مسارات الاكتشاف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال الكشف عن الطفرات المستحثة في الجينات المستهدفة مثل OsLCT1 و SPDT.
- القيمة التشغيلية: تعتمد تحليل HRM بعد تفاعل PCR دون الحاجة لمعالجة إضافية، مما يقلل من الوقت المستغرق في العمل اليدوي ويزيد من الإنتاجية.
- القيمة التنبؤية: تحدد قيم Delta F التي تزيد عن 0.5 العينات الطافرة، مما يدعم اختيار الإصابات بدقة من أجل التحقق اللاحق.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تمنع الأطباق المتوافقة مع تحليل HRM والمغطاة بطبقة من الزيت المعدني التبخر وتضمن الحصول على منحنيات انصهار قابلة للتكرار.
- المخرجات الكمية: تتيح منحنيات الانصهار المعيارية وقياسات delta F إجراء مقارنة موضوعية بين العينات من النوع البري والعينات المتغيرة.
- قابليّة التوسع: يتيح تنسيق الطبق ذو الـ 96 بئراً فحص الآلاف من شتلات M2، كما تم توضيحه باستخدام 4,560 عينة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: توفر الطفرات المؤكدة عبر تسلسل سانجر بيانات الآفة الجزيئية التي تربط النمط الجيني بالنمط الظاهري في برامج التربية.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: تعمل تعددات أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) وعمليات الإدخال والحذف (indels) المحددة كمؤشرات قابلة للكشف لارتباط السمات في تحسين المحاصيل.
- الحد من المخاطر: يقلل الكشف المبكر عن الطفرات من حالة عدم اليقين في وراثة السمات قبل التجارب الميدانية.
تكامل سير العمل والمسار التحليلي
يندرج نظام HRM-TILLING ضمن التسلسل الممتد من الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، حيث يتيح فحص الطفرات بعد عملية التطفير وقبل التحقق المظهري، مما يدعم تحديد السلالات الرائدة في مجال التكنولوجيا الحيوية الزراعية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال تحديد المتغيرات الأليلية في الجينات المستهدفة عبر تحليل منحنى الانصهار الحساس.
- الفحص: يقدم مخرجات تحليل HRM كمية وقابلة للتكرار تهدف إلى توحيد عملية الكشف عن الطفرات عبر مجموعات سكانية كبيرة.
- التحليلات: توفر عتبة Delta F (أكبر من 0.5) أساساً إحصائياً للتمييز بين العينات الطافرة والعينات من النوع البري.
- الأبحاث الترجمية: تتيح الطفرات المؤكدة بالتسلسل إمكانية رسم خرائط الربط بين النمط الجيني والنمط الظاهري لاتخاذ قرارات التربية المرتبطة بالسمات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: البروتوكول قابل للتكيف مع أهداف جينية مختلفة وأنواع محاصيل أخرى غير الأرز، مما يعزز إعادة استخدام المنصة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يكتشف كلًا من تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة (SNPs) والإضافات والحذوفات (indels) بحساسية عالية، مما يقلل من النتائج السلبية الكاذبة في فحص الطفرات.
- القيمة التشغيلية: يقلل استخلاص DNA البسيط والآمن والسريع (SSF) المقترن بتحليل صهر عالي الدقة (HRM) من استخدام الكواشف والاحتياجات من المعدات.
- القيمة الاستراتيجية: يتيح اتخاذ قرارات أسرع بالاستمرار أو التوقف في برامج التربية من خلال التحديد السريع للمتغيرات الأليلية المفيدة.
- التأثير على المحفظة: يعزز الثقة في تطوير السلالات ذات الطفرات الموثقة، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب الإلمام بإعداد جهاز HRM ومعايرة منحنى الانصهار.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة الدورات الحرارية المتدرجة (gradient thermal cyclers) لتحسين درجة حرارة الارتباط.
- يعتمد على أطباق متوافقة مع تقنية HRM وأصباغ فلورية لإجراء تحليل انصهار دقيق.
- يتطلب القدرة على إجراء التسلسل الجيني لتأكيد الطفرات التي تم تحديدها بواسطة HRM.
- قد يختلف الأداء بناءً على طول قطعة التضخيم ومحتوى GC، مما يستوجب إجراء تحسينات خاصة بكل هدف.
