اختبار قوي من تفاعل البوليميراز القائم على سلسلة لقياس السيتوسين-غوانين-غوانين ترينوكلوتيد يكرر في التهشاشة X التخلف العقلي-1 الجينات

يمكن لهذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة العثور على تطبيقات واسعة في التشخيص الجزيئي وفحص FXS والاضطرابات الهشة X ذات الصلة. انها سريعة في وقت التحول وأقل من الاستثمار في المعدات. يمكن أن تسهل مقايستنا القائمة على PCR تصنيف الطيف الكامل لـ FXS والاضطرابات الهشة المرتبطة بـ X ، بما في ذلك الوسيطة ، قبل التبدل ، والطفرة الكاملة مع المتانة ووقت الإبلاغ السريع.

وسوف تظهر الإجراء من قبل وينغ تشوا من بيركنزلمير سنغافورة. ابدأ بإزالة مزيج العازلة PCR، وعينات عينة مخففة، وعينات الحمض النووي من الفريزر 20 درجة مئوية، وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة للذوبان. قبل استخدام الكواشف، دوامة وتدور لفترة وجيزة لهم.

قياس تركيز عينة الحمض النووي مع مقياس الطيفي، وإذا لزم الأمر، تمييع إلى 25 نانوغرام لكل ميكرولتر مع ذوبان العينة. قم بتسمية آبار لوحة PCR لتحديد عينات الحمض النووي المرجعية والمختبرة وحساب عدد التفاعلات اللازمة للعينات الاختبارية والمرجعية والاختبارات السلبية. إعداد مزيج رئيسي PCR عن طريق الجمع بين 15 ميكرولترات من مزيج PCR العازلة إلى 0.6 ميكرولترات من عينة diluent و 0.4 ميكرولترات من البوليميراز لكل رد فعل.

دوامة المزيج وتدور عليه. ثم الاستغناء 18 ميكرولترات من الخليط في كل بئر. ثم ماصة اثنين من microliters من كل الحمض النووي في البئر المناسبة.

اخلط الكواشف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا خمس مرات، ثم ختم لوحة. ضع اللوحة في الدراجات الحرارية وادير الـ PCR وفقًا لاتجاهات المخطوطة. سخني حاضنة شاكر إلى 65 درجة مئوية وأضف 80 ميكرولترات من 1X TE العازلة لكل منتج PCR.

استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل العينات إلى لوحة تنظيف PCR ووضع لوحة في شاكر. احتضانه عند درجة حرارة 65 درجة مئوية بينما يرتجف عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة، تبريد شاكر الحاضنة وصولا الى 25 درجة مئوية، تعيين أداة فراغ إلى 250 ملليبار، وpirpirate الحل من خلال مرشح.

بعد 15 دقيقة، يجب أن يكون الآبار أي السائل المتبقية. إيقاف تشغيل الفراغ وإضافة 50 ميكرولترات من 1X TE العازلة لكل بئر. استلهم الحل لمدة 10 دقائق باستخدام إعدادات الفراغ السابقة.

جفف الجزء السفلي من لوحة التصفية عن طريق الضغط عليها بقوة على كومة من المناشف الورقية ثم إضافة 20 ميكرولترات من 1X TE العازلة إلى مركز أسفل كل بئر. ضع الطبق في الشاكر ويحضن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، نقل ما لا يقل عن 15 ميكرولترات من المنتج المنقى PCR إلى 96 لوحة PCR طازج.

قبل البدء، وجلب dna صبغة التركيز، مصفوفة هلام الحمض النووي، علامة الحمض النووي، سلم الحمض النووي، وعينات الحمض النووي النقية إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد محطة الفاتنة عن طريق استبدال الحقنة وضبط اللوحة الأساسية ، ثم حرر ذراع مقطع الحقنة وانزله إلى المركز العلوي. بدء برنامج التحجيم وإعداد مزيج صبغ هلام.

دوامة صبغ التركيز لمدة 10 ثوان، ثم تدور عليه. ثم، إضافة 25 ميكرولترات من الصبغة إلى قارورة مصفوفة هلام ودوامة الحل لخلط. نقل مزيج صبغة هلام إلى مرشح تدور، وضعه في الطرد المركزي، وتدور لمدة 10 دقائق في 1500 مرات ز.

عندما تكون على استعداد لتحميل مزيج صبغ هلام، إدراج رقاقة الحمض النووي جديدة في محطة فتيلة وإضافة تسعة ميكرولترات من مزيج صبغ هلام في البئر الذي تم وضع علامة مع G.Close محطة فتيلة وضمان أن يتم وضع المكبس في علامة ملليلتر واحد. اضغط على المكبس حقنة أسفل حتى يتم عقده من قبل مقطع. انتظر لمدة 30 ثانية بالضبط، ثم حرر القصاصة.

انتظر خمس ثوان أخرى، ثم سحب ببطء المكبس مرة أخرى إلى موقف ملليلتر واحد. فتح محطة فتيلة وإضافة تسعة microliters من مزيج صبغ هلام في الآبار ملحوظ مع G.Add خمسة microliters من علامة في علامة ملحوظ جيدا مع رمز سلم وكل من 12 عينة الآبار. إضافة ميكرولتر واحد من السلم إلى البئر مع رمز سلم وميكر واحد من المنتج PCR أو الماء إلى آبار العينة.

دوامة رقاقة لمدة دقيقة واحدة في 2400 دورة في الدقيقة. أدخله في الـ bioanalyzer و قم بتشغيل الرقاقة خلال خمس دقائق. عند اكتمال التشغيل، قم بتصدير بيانات الذروة كملفات جدول csv.

وتستخدم عينة أنثى ما قبل التبدل وعينة أنثى طفرة كاملة كعينات مرجعية. يتم تضمين ذروة علامة أعلى وأدنى في ملف تعريف حجم الجزء، وعادة ما يكون هناك ذروة مجمع التمهيدي في حوالي 95 أزواج قاعدة. يتم استخدام هذه العينات المرجعية لإنشاء منحنى انحدار قياسي.

ثم يتم استخدام منحنى الانحدار المعياري الخطي لحساب أحجام التكرار للعينات غير المعروفة. يمكن تصنيف عينات الطفرات السريرية العادية والمتوسطة، قبل التبدل، والطفرة الكاملة، والفسيفساء بشكل صحيح باستخدام هذه الطريقة. في بعض الحالات، يتم عرض ذروة واحدة فقط في نتائج الكهرباء الدقيقة الفلورية، والتي من المرجح أن يرجع ذلك إلى وجود الأليليسات المتجانسة العادية.

نوع واحد من النتائج دون المستوى الأمثل هو التحيز خط الأساس، والتي يمكن أن تكون غامضة أو غير تفسير، ويشتبه في أن يكون سببها عطل في الجهاز. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ضمان كمية مناسبة من الحمض النووي والجودة قبل بدء البروتوكول. يمكن إجراء تسلسل الجينات FMR1 لتحديد نمط انقطاع AGG.

ويمكن استخدام إنزيم التقييد الحساس للميثيل أو مقايسة تعديل ثنائي السلفيد لمراقبة حالة الميثيل. هذه تقنية سريعة وقوية وفعالة من حيث التكلفة. وسوف يساعد الباحثين الآخرين في إجراء دراسة قائمة على السكان على حالة الناقل من FXS والاضطرابات الهشة X المرتبطة.