Name: تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: تعلم إعداد مكتبات تسلسل RNAs الدائرية باستخدام معالجة RNase R وتحسين كمية العينة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد circRNAs بدقة في عينات RNA الكليّة لفهم توزيع التعبير الجيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن ممتنون لمعهد البحوث الصحية الشمس راية الدماغ والجسم برنامج التبرع (BBDP) من صن سيتي, ولاية اريزونا لتوفير انسجه المخ البشرية. وقد تم دعم BBDP من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (U24 NS072026 الوطنية الدماغ والانسجه الموارد لمرض باركنسون والاضطرابات ذات الصلة) ، المعهد الوطني للشيخوخة (P30AG19610 اريزونا مرض الزهايمر مركز الاساسيه), ولاية اريزونا قسم الخدمات الصحية (عقد 211002, اريزونا مركز البحوث الزهايمر), ولاية اريزونا لجنه البحوث الطبية الحيوية (عقود 4001, 0011, 05-901 و 1001 إلى اتحاد مرض باركنسون في ولاية اريزونا) ومايكل J. مؤسسه فوكس للبحوث باركنسون27. وقد دعمت هذه الدراسة أيضا من قبل وزاره التعليم الوطني وولاية اريزونا (ADHS منحه # ADHS14-052688). كما نشكر أندريا شميت (بحث بانر) وسينثيا ليهوغا (TGen) للدعم الإداري.

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733(2012).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li>
<li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li>
<li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrambled+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).</li>
<li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li>
<li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li>
<li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p%2FmiR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919(2016).</li>
<li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIRI%3A+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MapSplice%3A+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).</li>
<li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).</li>
<li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant%2C+conserved%2C+and+dynamically+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li>
<li>Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).</li>
<li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).</li>
<li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACValidator%3A+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li>
<li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circular+RNAs%3A+bioinformatic+and+experimental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li>
<li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).</li>
<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

وفي هذه الدراسة ، تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبات المتاحة تجاريا ، وخيارات ما قبل المعالجة ، وكميات الحمض الريبي للإدخال من أجل تحسين بروتوكول إثراء circRNA لبناء مكتبات تسلسل circRNA. واستنادا إلى تقييمات هذه الدراسة ، فان عددا من الجوانب الرئيسية والخطوات الحاسمة في إنشاء مكتبات تسلسل circRNA واضحة. ويؤكد تقييمنا فائده المعالجة المسبقة RNase R ، كما ينعكس ذلك في زيادة عدد circRNAs المكتشفة. وبشكل عام ، لوحظ وجود تنوع اعلي من circRNAs عند استخدام مجموعه المكتبات الخاصة بشركه "الومينا" مع RNase R قبل المعالج...

التعميم rnas (circrnas) هي الذاتية ، وغير الترميز rnas التي اكتسبت الاهتمام نظرا لتعبيرها المتفشي في الناسخة النواة1،2،3. يتم تشكيلها عندما الاكسون العودة لصق لبعضها البعض ، التالي اعتبرت في البداية ان تكون التحف الربط4،5. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات الاخيره ان circrnas المعرض نوع الخلية ، والانسجه ، والتنمية المرحلة المحددة التعبير3،6 ويتم الحفاظ علي التطور2،3. وعلاوة علي ذلك ، فهي تشارك في الوساطة من البروتين والبروتين التفاعلات7، الصغرى الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) ملزمه3،8،9،10، وتنظيم النسخ الجيني الابويه11.
في تسلسل RNA الكلاسيكية (الحمض الريبي النيبالي-seq) ، circRNAs قد تكون فقدت تماما اثناء بناء المكتبة نتيجة لاختيار بولي-A ل mRNAs أو قد يكون من الصعب عزل نظرا لوفره منخفضه. ومع ذلك ، فقد أدرجت الدراسات الحديثة لتوصيف الخصائص خطوه ما قبل المعالجة باستخدام rnase R من أجل إثراء circrna2،12،13. RNase R هو اكسوريبونوكليسي التي يهضم RNAs الخطية ، تاركا وراءها هياكل الحمض الريبي النيبالي الدائري. تم تحسين بروتوكولات التخصيب CircRNA عن طريق توليد ومقارنه البيانات من اثنين المتاحة تجاريا مجموعات البناء مكتبه النسخ ، مع وبدون خطوه RNase R قبل العلاج ، واستخدام كميات متفاوتة من الدخل الكلي RNA (1 إلى 4 ميكروغرام). وكان البروتوكول الأمثل تستخدم المقبل لتقييم وفره من circRNAs عبر خمس مناطق الدماغ المختلفة (المخيخ [BC] ، الفص الجداري السفلي [الملكية الفكرية] ، الجيروسكوب الصدغي الأوسط [MG] ، القشرة القذالي [OC] والجيروسكوب الامامي المتفوق [SF]) وأربعه أنواع أخرى من الانسجه (الكبد [LV] ، الرئة [LU] ، العقدة الليمفاوية [LN] والبنكرياس [PA]). وكانت المكتبات التي تليها الحمض الريبي النيبالي-المتسلسلة المتعاقبة وتحليل البيانات باستخدام سته مختلفه خوارزميات التنبؤ circRNA: find_circ3، ciri14، mapsplice15، سكين16، dcc17، و سيرسيكسبلورير18. واستنادا إلى تحليلنا ، تم الكشف عن أكبر عدد من circRNAs فريدة من نوعها عند استخدام مجموعه من الذين تقطعت بهم السبل اعداد مكتبه الحمض الريبي النيبالي مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام إجمالي المدخلات RNA. يتم وصف البروتوكول الأمثل هنا. كما ذكر سابقا19,20, لوحظ اعلي إثراء من circrnas في الدماغ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.

<table><tbody><tr><td>1,000 & ميكرو; أطراف ماصة L</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 & micro; أطراف ماصة</td><td>L Rainin</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro; أطراف ماصة</td><td>L Rainin</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 ملحقات TapeStation (أغطية رقائق معدنية)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 ملحقات TapeStation (نصائح)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>فيلم لاصق للألواح الدقيقة</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads 450 مل</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>تنقية PCR</td></tr><tr><td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates</td><td>VWR</td><td>951020401</td><td></td></tr><tr><td>كواشف D1000 عالية الحساسية</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>عالية الحساسية D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 نظام التسلسل</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 PE مجموعة العنقود</td><td>Illumina</td><td>طقم التسلسل PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 SBS (150 دورة)</td>نظام تسلسل <td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq PE Rapid Cluster Kit v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 دورة)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Total RNA Kit</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr> مركز توريد أنابيب <tr><td>فحص كيوبيت من درجة البيولوجيا الجزيئية من الإيثانول</td><td>فيشر العلمي</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>كيوبيت</td><td>بواسطة Thermo Fischer</td><td>Q32856</td><td></td></tr> مركز توريد <tr><td>مجموعة أدوات الفحص عالية الإحساس QUBIT dsDNA</td><td>بواسطة Thermo Fischer</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>تنظيف ومكثف الحمض النووي الريبي - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>يحتوي على أعمدة تنقية وأنابيب تجميع</td></tr><tr><td>RNAClean XP الخرز</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>RNA Cleanup Beads</td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 وحدة</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td> <td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>محلل الحمض</td></tr><tr><td>النووي TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الشاملة TruSeq TruSeq</td><td>Illumin</td><td>20020596</td> a <td>المستخدمة في القسم 3</td></tr> صينية <tr><td>مقسمة من قسمين</td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr>مركز إمدادات<td>المياه فائقة النقاء</td><td>بواسطة Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>التحكم العالمي RNA</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

تحديد rnas الدائري باستخدام تسلسل rna

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

التعميم RNAs (circRNAs) هي فئة من غير الترميز RNAs المشاركة في وظائف بما في ذلك مايكرو الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) التنظيم ، والوساطة من التفاعلات بروتين البروتين ، وتنظيم النسخ الجيني الابويه. في الجيل التالي الكلاسيكية RNA تسلسل (RNA-seq) ، يتم تجاهل circRNAs عاده نتيجة لاختيار بولي-A اثناء بناء المكتبات mRNA ، أو وجدت في وفره منخفضه جدا ، التالي من الصعب عزل وكشف. هنا ، تم تحسين بروتوكول إنشاء مكتبه circRNA عن طريق مقارنه مجموعات اعداد المكتبة ، وخيارات ما قبل العلاج ومختلف الكميات الاجماليه لإدخال الحمض الريبي النيبالي. وقد تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة المتاحة تجاريا ، مع وبدون RNase R قبل المعالجة ، وباستخدام كميات متغيرة من إجمالي دخل الحمض الريبي النيبالي (1 إلى 4 ميكروغرام). وأخيرا ، أنواع متعددة من الانسجه ؛ بما في ذلك الكبد, الرئة, العقدة الليمفاوية, والبنكرياس; فضلا عن مناطق الدماغ متعددة; بما في ذلك المخيخ ، والفص الجداري السفلي ، والجيروسكوبات الصدغية الوسطي ، والقشرة القذالي ، والجيروسكوبات الاماميه المتفوقة. تمت مقارنتها لتقييم وفره circRNA عبر أنواع الانسجه. تحليل البيانات التي تم إنشاؤها الحمض الريبي-seq باستخدام سته مختلفه circRNA أدوات الكشف (find_circ ، CIRI ، Mapsplice ، سكين ، DCC ، و سيرسيكسبلورير) كشفت ان مجموعه من الجيش النيبالي السماوي اعداد مكتبه مجموعه عده مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام الحمض الريبي المدخلات هو الأمثل طريقه لتحديد العدد النسبي الأعلى من circRNAs. وتماشيا مع النتائج السابقة ، لوحظت اعلي نسبه إثراء في انسجه المخ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.

تم تقييم البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام السيطرة العالمية المتاحة تجاريا RNA (UC) واستخدام مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة ، وكلاهما يتضمن خطوه لاستنفاد الأوزون في بروتوكولاتهما. باستخدام سير عمل تحليلي (سير عمل تحليل البيانات ، القسم 4) ، بشكل عام ، تم الكشف عن عدد أكبر من circRNAs في مجموعات بيانات دعامات بالمقارنة مع Kapa (الشكل 1). وعلي الرغم من ان النسب المئوية لل RNA الريبي (rRNA) كانت اقل من 5 في المائة في مجموعات البيانات من كلتا المجموعتين بالنسبة لكميات المدخلات المنخفضة (1 ، 2...

التعميم RNAs (circRNAs) هي غير الترميز RNAs التي قد يكون لها ادوار في التنظيم عبر المعاقين والتوسط التفاعلات بين البروتينات. بعد تقييم المعلمات المختلفة لبناء مكتبات التسلسل circRNA ، تم تجميع بروتوكول باستخدام مجموع تقطعت بهم السبل الجيش النيبالي اعداد المكتبة مع RNase R ما قبل العلاج ويرد هنا.

تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

هذا البروتوكول هو نتيجة لتقييم الجوانب الرئيسية لإعداد مكتبة circrna، مثل نوع مجموعة، RNase R العلاج، كميات المدخلات وتأثيرها على الكشف عن سر الجيش الملكي النيبالي. وهو يتيح الكشف الأمثل عن الـCIRCRNA ويوفر بيانات عن المعلمات القابلة للتعديل حسب احتياجات المستخدم. إن تحديد الدوائر في أنواع عينات مختلفة سيساعدنا على فهم توزيع تعبيراتها بشكل أفضل ويمهد الطريق لتحديد الدور الوظيفي لهذه الجزيئات.يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي عينة RNA الإجمالي. من المهم الاحتفاظ بعينات الحمض النووي الريبي على الجليد قبل بدء البروتوكول. تقييم القيم RIN و DV200 على Bioanalyzer Agilent أو TapeStation قبل الإعدادية، واتبع الإجراءات المناسبة عند العمل مع RNA.تبدأ عن طريق تمييع الجيش الملكي النيبالي مجموع إلى أربعة ميكروغرام في 39 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase و pipetting ه صعودا وهبوطا لخلط. في أنبوب منفصل، استخدم 1x RNase R Buffer لتمييع RNase R إلى تركيز عمل يبلغ وحدتين لكل ميكرولتر. Pipette 39 ميكرولترات من مجموع الحمض النووي الريبي وخمسة ميكرولترات من 10x RNase R رد فعل العازلة في أنبوب رد فعل 1.5 ميكرولتر، ومزيج.إضافة ستة ميكرولترات من RNase المخفف R.Then ضبط ماصة لحجم التفاعل الكامل، وخلط الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مع التأكد من أن حجم التفاعل الكامل مغمور في حمام الماء. ثم، ضع الأنبوب على الجليد، والمضي قدما على الفور مع تنظيف الجيش الملكي النيبالي والتركيز.قبل البدء، وإعداد العازلة غسل RNA عن طريق خلط التركيز مع 48 ملليلتر من الإيثانول 100٪، ووضع أعمدة تنقية في أنابيب جمع. عندما تكون جاهزة، إضافة اثنين من وحدات التخزين من RNA ملزمة المخزن المؤقت إلى RNase R-المعالجة العينة، ومزيج جيد. إضافة 150 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى الخليط لما مجموعه 300 ميكرولترات، ونقل وحدة التخزين بأكملها إلى العمود، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية.إزالة تدفق من خلال، وإضافة 400 ميكرولترات من RNA الإعدادية العازلة مباشرة إلى العمود. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية، والتخلص من خلال تدفق. ثم، إضافة 700 ميكرولترات من مخزن غسيل الحمض النووي الريبي إلى العمود، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية، وتجاهل تدفق من خلال.إضافة 400 ميكرولترات أخرى من الغسيل العازلة، والطرد المركزي لمدة دقيقتين، ونقل العمود إلى أنبوب جديد RNase خالية من 1.5 ملليلتر. إضافة بعناية 11 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase مباشرة إلى العمود عن طريق عقد تلميح ماصة الحق فوق مرشح العمود. دع العينة تجلس لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة.تأكد من تدفق من خلال في أنبوب 1.5 ملليلتر، وتجاهل العمود. يمكن تخزين عينة الحمض النووي الريبي المنقى في ناقص 80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لإعداد المكتبة. نقل 10 ميكرولترات من RNA مجموع تنقية إلى بئر نظيفة في لوحة PCR 96-well.إضافة خمسة microliters من RRNA ملزمة العازلة تليها خمسة microliters من مزيج إزالة RRNA، ثم ماص بلطف صعودا وهبوطا لخلط الكواشف. ختم لوحة، واحتضانه لمدة خمس دقائق في 68 درجة مئوية على كتلة ثيرموسيسير مسبق البرمجة ومحمّاة مسبقا. بعد الحضانة، والسماح لوحة الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.إزالة الختم من لوحة، وإضافة 35 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة دوامة rRNA الخرز إزالة إلى العينة. ضبط ماصة إلى 45 ميكروليترس، وماصات صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرات لخلط دقيق. دع اللوحة تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.نقل لوحة إلى موقف مغناطيسي، واحتضان هناك لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم مسح الحل. نقل فائقة إلى بئر جديدة على لوحة. ثم نقل لوحة من موقف المغناطيسي إلى لوحة حامل.دوامة RNA تنظيف الخرز حتى يتم تفريقها بشكل جيد، وإضافة 99 ميكرولترات من الخرز إلى العينة. الماصات صعودا وهبوطا لخلط، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. نقل لوحة إلى موقف المغناطيسي، وتركها هناك لمدة خمس دقائق أو حتى الحل مسح، ثم إزالة وتجاهل جميع supernatant من البئر.مع لوحة لا تزال على موقف المغناطيسي، إضافة 200 ميكرولترات من الطازجة أعد 80٪ الإيثانول إلى البئر دون تعطيل الخرز. اترك الإيثانول في البئر لمدة 30 ثانية، ثم قم بإزالته والتخلص منه. إضافة 11 ميكروليتر من عازلة Elution إلى البئر، وماصة لأعلى ونضزال لخلط.احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين، ثم نقله مرة أخرى إلى موقف المغناطيسي، والاحتفاظ بها هناك حتى يتم مسح الحل. نقل 8.5 ميكرولترات من السوبر إلى بئر جديدة على نفس اللوحة، وإضافة 8.5 ميكرولترات من إلوت، التمهيدي، جزء عالية ميكس إلى كل بئر تحتوي على عينة. الماصات صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط جيدا، وختم لوحة، واحتضانه لمدة ثماني دقائق في الحرارية محمّاة مسبقا إلى 94 درجة مئوية.تبريد العينة إلى أربع درجات مئوية، وإزالة لوحة من الدراجات الحرارية، والطرد المركزي لفترة وجيزة. وتم تقييم طقمتين لإعداد المكتبات، هما تروسك وكابا، لهذا البروتوكول. وعموما، تم الكشف عن عدد أكبر من RNAs التعميم وانخفاض نسبة من الحمض النووي الريبي الريبوسي عند استخدام مجموعة TruSeq، لذلك تم اختيار TruSeq لإجراء مزيد من التجارب.تم تقييم أهمية المعالجة المسبقة RNase R بمقارنة البيانات المتولدة من المكتبات المعالجة المسبقة وغير المعالجة مسبقة. وكما هو متوقع، تم تحديد عدد أكبر من الرنا قدامى التعميم في المكتبات المعالجة المسبقة مقارنة بالمكتبات غير المعالجة. تم تحسين كمية الإدخال RNA للكشف عن تنوع أعلى من الحمض النووي الريبي الدائري.تم إعداد المكتبات باستخدام واحد واثنين وأربع ميكروغرام من المدخلات RNA، ولوحظ أعلى تنوع من أنواع الحمض النووي الريبي الدائري عند استخدام أربعة ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. وقد استخدم البروتوكول الأمثل لمقارنة وفرة الجيش الملكي النيبالي الدائري في خمس مناطق في الدماغ من أربعة متبرعين أصحاء والأنواع الأخرى من الأنسجة من ستة متبرعين أصحاء. عموما، لوحظ وجود وفرة أعلى من RNase دائرية في الدماغ مقارنة مع أنواع الأنسجة الأخرى.من المهم أن نتذكر أن تتبع الإجراءات المناسبة عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي، بما في ذلك ارتداء القفازات، وتنظيف جيدا مقاعد البدلاء والماصات مع مناديل RNase أو رذاذ قبل البدء في البروتوكول، والحفاظ على RNA على الجليد مسبقا. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء التحقق من صحة متعامد مثل تسلسل Sanger من تقاطعات محيطة عرنيا محددة. اكتشاف الدوائر الجديدة والمزيد من الأدلة على وجودها يقتطع مجالا جديدا من البحوث لاستكشاف وظائفها البيولوجية.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

نحن نسخ وتحليل الجينات مراسل توليد الحمض النووي الريبي دائرية. هذه الجينات المراسل ة أكبر من الإنشاءات لتحليل الربط الخطي وتحتوي على عناصر Alu. للتحقيق في الحمض النووي الريبي الدائري ، يتم نقل المنشئات إلى الخلايا ويتم تحليل الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام RT-PCR بعد إزالة الحمض النووي الريبي الخطي.

استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري

هنا، نقدم بروتوكوللإثراء مواقع ربط الحمض النووي الريبي الذاتية أو "آثار أقدام" من RNA: البروتين (RNP) المجمعات من خلايا الثدييات. وينطوي هذا النهج على هطول يناهي الأمطار المناعية للوحدات الفرعية RNP، وبالتالي يطلق عليه اسم الترسيب المناعي للرنا جنبا إلى جنب (RIPiT).

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

نقدم استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR من خلال الجمع بين التعميم RT-PCR، الكمية RT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، ووصمة عار الشمالية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة تطبيع للتقليل إلى أدنى حد من تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر 5'، وهو مناسب للتمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوتشوندريون الذرة.

التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR

يصف هذا البروتوكول الطريقة التفصيلية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية (dd-PCR) من أجل التحديد الكمي الدقيق لمستويات الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA) في الخلايا باستخدام بادئات متباينة.

القياس الكمي للحمض النووي الريبي الدائري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية

يشرح البروتوكول المقدم هنا خط أنابيب السيليكو الكامل اللازم للتنبؤ بالحمض النووي الريبي الدائري وتوصيفه وظيفيا من بيانات نسخ تسلسل الحمض النووي الريبي التي تدرس تفاعلات المضيف والممرض.

في سيليكو تحديد وتوصيف الحمض النووي الريبي السيرك أثناء التفاعلات بين المضيف والممرض

تسلسل الحمض النووي الريبي الكمي المطلق (AQRNA-seq) هو تقنية تم تطويرها لتحديد المناظر الطبيعية لجميع الحمض النووي الريبي الصغير في الخلائط البيولوجية. هنا ، يتم عرض كل من خطوات إعداد المكتبة ومعالجة البيانات الخاصة ب AQRNA-seq ، وتحديد التغيرات في تجمع الحمض النووي الريبي الناقل (tRNA) في المتفطرة البوفية BCG أثناء السكون الناجم عن الجوع.

AQRNA-seq لقياس كمية الحمض النووي الريبي الصغير

تسلسل وحيد الخلية هو أداة شعبية متزايدة ويمكن الوصول إليها لمعالجة التغيرات الجينية بدقة عالية. ونحن نقدم البروتوكول الذي يستخدم التسلسل خلية واحدة لتحديد عدد النسخ تغييرات في الخلايا وحيدة.

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجينة (سبلاش)، والتي تمكن رسم الخرائط على نطاق الجينوم التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات رنا-رنا في الجسم الحي . سبلاش يمكن تطبيقها لدراسة رنا تفاعلات الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والبكتيريا والبشر.

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

ظهرت المجرة وDAVID كأدوات الشعبية التي تسمح للمحققين دون تدريب المعلوماتية الحيوية لتحليل وتفسير البيانات RNA يليها. نحن تصف بروتوكول للC. ايليجانس الباحثين لإجراء التجارب، والوصول RNA يليها ومعالجة بيانات باستخدام جالاكسي والحصول على المعلومات البيولوجية ذات مغزى من القوائم الجين باستخدام DAVID.

تحليل Transcriptomic من<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; ايليجانس</em&gt; RNA تسلسل البيانات من خلال جناح سهرة على مشروع غالاكسي

يصف لنا منصة تحليل الحمض النووي الريبي نقل الأصلي المسمى بقعة (منهاج مبسط لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال). بقعة في الوقت ذاته تدابير الخلوية مستويات ترنس جميع العينات البيولوجية وفي ثلاث خطوات فقط، وفي أقل من 24 ساعة.

وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

تعلم إعداد مكتبات تسلسل RNAs الدائرية باستخدام معالجة RNase R وتحسين كمية العينة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد circRNAs بدقة في عينات RNA الكليّة لفهم توزيع التعبير الجيني.

تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA

استكشف المزيد من الفيديوهات