تعديل التعريب تاو Subcellular كاداه للتحقيق في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمرض
ديسمبر 20, 2019
تاو هو بروتين الخلايا العصبية الموجودة علي حد سواء في السيتوبلاسما ، حيث انه يربط الأنابيب الدقيقة ، وفي النواة ، حيث يمارس وظائف غير تقليديه بما في ذلك تحوير الجينات المرتبطة بمرض الزهايمر. هنا ، ونحن وصف طريقه للتحقيق في وظيفة تاو النووية في حين استبعاد اي تدخلات قادمه من السيتوبلازمي تاو.
ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الدور المباشر لتاو في المقصورة النووية مع استبعاد أي تلوث محتمل من التاو السيتوبلازمي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنطبق على نطاق واسع على الدراسة المتعلقة بالوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى وفي ظل ظروف خلوية مختلفة. إثبات الإجراء سيكون جياكومو سيانو، طبيب ما بعد الدكتوراه من مختبري.
تبدأ عن طريق الطلاء أربع مرات 10 إلى خمس خلايا خط الخلايا الأرومية العصبية البشرية S-SY5Y التي سيتم نقلها مع ناقل التحكم الفارغ، أربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي سيتم تحويلها إلى تاو غير الموسومة، أربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي سيتم إرسالها إلى تاو-NLS، وأربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي يتم نقلها مع تاو-NES في آبار فردية من طبق من ستة آبار. في اليوم التالي للطلاء ، بشكل منفصل احتضان 400 نانوغرام من الحمض النووي والحجم المناسب من الدهون الموجبة في أنبوب واحد من 250 ميكرولترات من المصل المخفض في البئر. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، والجمع بين كل ناقل مع حجم واحد من الدهون الموجبة واحتضان مجمعات الدهون الحمض النووي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، استبدال االنابات في كل بئر مع مليلترين من الثقافة الكاملة الطازجة المتوسطة وtransfect كل بئر مع الحل المناسب الدهون الحمض النووي المعقدة لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل المُتَسَنّون بوسيلة تمايز جديدة. لتحليل لطخة الغربية، وغسل الخلايا المُصابة والمتمايزة في كل بئر مع برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع 500 ميكرولترات من 0.1٪ التربسين في بئر لمدة أربع دقائق في 37 درجة مئوية.
عندما تكون الخلايا قد فصلت، ووقف رد فعل مع حجم متساو من المتوسط كاملة ونقل تعليق الخلية من كل بئر إلى أنابيب الفردية للطرد المركزي. بعد إزالة بعناية من المواد الخارقة، resuspend الكريات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب للطرد المركزي الثاني وإزالة عظمى مرة أخرى. لاستخراج البروتين الكلي، احتضان الكريات لمدة 30 دقيقة على الجليد في 50 إلى 100 ميكرولتر من عازلة تحلل تكملها مثبطات البروتياز والفوسفاتاز.
في نهاية الحضانة، الطرد المركزي استخراج في 16، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة، وتحديد تركيز البروتين عن طريق أي معيار القياس الكمي. ثم اخلط 20 ميكروغرام من كل عينة بروتين مع خمس ميكرولترات من عازل 4X Laemmli إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولترات وغلي العينات في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بالنسبة للكسر دون الخلوي، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل للعد والدوران لأسفل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل عينة.
لعزل الكسر السيتوسوليك، احتضان الكريات في 100 ميكرولترات من الجليد البارد سيتوبلازمميك استخراج العازلة تكملها مثبطات البروتياز في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وجمع العينات عن طريق الطرد المركزي ونقل المابس إلى أنابيب ما قبل التبريد. إضافة 100 ميكرولترات من الجليد الباردة استخراج الأغشية العازلة تستكمل مع مثبطات البروتياز إلى بيليه لاحتضان 10 دقيقة في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف.
ثم الطرد المركزي الكريات لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 3،000 مرات ز وجمع supernatants في أنابيب جديدة. لجمع الكسر النووي القابل للذوبان، أضف 50 ميكرولترات من مخزن الاستخراج النووي المكمّل بمثبطات البروتياز إلى الكريات ذات الدوامة قبل احتضان العينات بأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينات وجمع اابر.
لجمع الكسر النووي غير القابل للذوبان، أضف 50 ميكرولترات من مخزن الاستخراج النووي المكمل بمثبطات البروتياز، كلوريد الكالسيوم والنيوكلاز الدقيق إلى الكريات ذات الدوامة. احتضان العينات لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية قبل دوامة وrifuging. ثم جمع ابر.
لجمع كسر الهيكل العظمي، إضافة 50 ميكرولترات من العازلة استخراج الهيكل العظمي cyto والهيكل العظمي تكملها مثبطات البروتياز إلى الكريات مع دوامة. بعد حضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي العينات وجمع اغراء. لتحليل SDS-PAGE، إضافة سبعة ميكرولترات من 4X Laemmli العازلة إلى 20 ميكرولترات من كل من العينات الكسر دون الخلوية التي تم جمعها وغلي العينات في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
في نهاية الحضانة، تحميل العينات على هلام الاكريلاميد وتنفيذ الكهرباء في الجهد المستمر من 120 فولت. ثم نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز في 250 مللي امبير لمدة 90 دقيقة. احتضان الغشاء لمدة خمس دقائق في بونساو تلطيخ حل للتحقق من وجود البروتين السليم هلام electrophoresis والنشاف ناجحة.
في نهاية الحضانة، شطف الغشاء في الماء المقطر حتى الخلفية نظيفة وإزالة وصمة عار مع الغسيل المستمر مع تريس المخزنة المالحة تكملها توين 20 لمدة 10 دقائق على شاكر. بعد ذلك، احتضان الغشاء مع محلول منع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قبل غسل ثلاث مرات مع محلول ملحي تريس المخزنة بالإضافة إلى توين 20 لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل الأخير ، تهجين الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في حل منع بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تليها ثلاثة يغسل مع محلول ملحي تريس المخزنة بالإضافة إلى توين 20 لمدة خمس دقائق.
بعد الغسيل الأخير ، تهجين الغشاء مع جسم مضاد ثانوي مناسب من الفجل peroxidase في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الغشاء بالمحلول الملحي المخزنة على تريس بالإضافة إلى توين 20 ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسيل. بعد الغسيل الأخير ، الكشف عن الفرقة البروتين باستخدام chemiluminescence وقياس شدة عصابات لطخة الغربية من قبل ImageJ. في غياب حمض الريتينويك وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ، والخلايا SH-SY5Y غير المتمايزة تفترض شكل دائري وكتل الخلايا الشكل.
كما هو متوقع ، بعد خمسة أيام من العلاج بحمض الريتينويك ، تسترخي الكتل وتنتشر الخلايا. بعد ثلاثة أيام إضافية من العلاج مع عامل التغذية العصبية المشتقة من الدماغ ، تظهر الخلايا موزعة بشكل موحد ومتشابكة عبر شبكة من النوريات المتفرعة. بعد تاو-NLS أو تاو-NES transfection, تاو التعريب دون الخلوية يمكن الكشف عن طريق immunofluorescence مع الأجسام المضادة المضادة تاو.
اعتمادا على كفاءة transfection، والخلايا عرض تلطيخ نووي قوي مع إشارة DAPI بعد تسربل تاو-NLS أو تلطيخ السيتوبلازمي مع نوى فارغة بعد تاو-NES. ويكشف تحليل البلوط الغربي عن إثراء الـ actin داخل الكسر الهيكلي، والتبولين داخل الكسور السيتوبلازمية والسيكومية، وH2B داخل الكسور النووية. كما يؤكد تحليل البلوط الغربي التعبير عن تاو الموسوم وغير الموسومة داخل المقصورة النووية ونقل الغلوتامات في حويغية تعبير واحد في المقتطف الكلي.
في الواقع، فإن نسبة تاو في الكسور النووية والسيكتوبلازمية القابلة للذوبان تسلط الضوء على حقيقة أن تاو-NLS يتم تخصيبه بدرجة عالية في الجزء النووي القابل للذوبان بينما يتم تقليل تاو-NES. وعلاوة على ذلك، يتم إثراء تاو-NLS في الكسر المرتبط بالكروماتين فيما يتعلق بالكسر السيتوبلازمي بينما ينخفض تاو-NES. تأكد من فحص بعناية عدد الخلايا المستخدمة لتجزئة كل عينة والتحقق من إثراء الجينات التدبير المنزلي في الكسور المناسبة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على عزل المقصورات الخلوية وتقييم الدور الوظيفي لتاو في النواة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لاستقصاء دور بروتين Tau النووي، وهو بروتين مرتبط بمرض ألزهايمر، مع استبعاد التداخل الناتج عن بروتين Tau السيتوبلازمي. وتعد هذه التقنية قابلة للتطبيق عبر مختلف أنواع الخلايا والظروف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علوم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث مرض الزهايمر
خلفية علمية
- بروتين Tau هو بروتين عصبي يشارك في الارتباط بالأنيبيبات الدقيقة.
- وله وظائف غير تقليدية داخل النواة.
- قد يعمل بروتين Tau النووي على تنظيم الجينات المرتبطة بمرض Alzheimer.
- يعد فهم دوره أمراً بالغ الأهمية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية.
الغرض من الدراسة
- لبحث وظيفة بروتين Tau النووي دون حدوث تلوث سيتوبلازمي.
- لتوفير طريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة Tau في سياقات خلوية متنوعة.
- لتعزيز فهم دور Tau في الأمراض التنكسية العصبية.
الطرق المستخدمة
- ترنصيف خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y بتركيبات مختلفة من بروتين Tau.
- استخدام الدهون الكاتيونية لإيصال الحمض النووي DNA.
- حضن معقدات DNA-الدهون لتسهيل عملية الترنصيف.
- عزل بروتين Tau النووي لإجراء التحليل الوظيفي.
النتائج الرئيسية
- تستبعد هذه الطريقة بنجاح تلوث Tau السيتوبلازمي.
- تتيح هذه الطريقة الدراسة المباشرة لوظائف Tau النووية.
- تم إثبات إمكانية تطبيقها على أنواع وخلايا وظروف مختلفة.
- توفر رؤى حول دور Tau في تعديل الجينات المرتبطة بمرض Alzheimer's.
الاستنتاجات
- تعد هذه التقنية أداة قيمة لدراسة بروتين Tau النووي.
- تفتح هذه التقنية آفاقاً جديدة للبحث في الأمراض التنكسية العصبية المرتبطة ببروتين Tau.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة لاستكشاف الوظائف المتنوعة لبروتين Tau.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح هذه الطريقة استقصاءً دقيقاً لوظيفة بروتين Tau النووي في التعبير الجيني، مما يعالج فجوة حرجة في التحقق من أهداف مرض ألزهايمر. ومن خلال عزل Tau النووي عن التداخل السيتوبلازمي، فإنها تدعم الحد من المخاطر الآلية للمسارات النسخية المعتمدة على Tau. يوفر هذا النهج أداة قابلة للتطوير وواسعة التطبيق لتقييم تعديل الجينات المرتبطة بالمرض في النماذج العصبونية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح التقييم المباشر لدور بروتين Tau النووي في تنظيم الجينات المرتبطة بالمرض، مثل VGluT1.
- القيمة التشغيلية: تستخدم تقنيات التعداء (transfection) والتجزئة (fractionation) القياسية المتوافقة مع سير العمل الحالي في علوم الأعصاب.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من العزو الخاطئ لتأثيرات التعبير الجيني إلى بروتين Tau السيتوبلازمي، مما يعزز الثقة في تحديد الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد بيانات كمية عن تجزئة المكونات الخلوية لربط تموضع بروتين Tau بالتعبير عن الجينات المستهدفة.
- القيمة التشغيلية: استخدام طرق كلاسيكية موثوقة (التحلل، والطرد المركزي، ولطخة ويسترن) القابلة لتقييس المقايسات.
- القيمة الاستراتيجية: دعم تطوير قراءات قابلة للتكرار لنشاط بروتين Tau النووي في سلاسل الفرز.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يربط بروتين Tau النووي بمسارات إطلاق الغلوتامات ذات الصلة بالفيزيولوجيا المرضية المبكرة لمرض الزهايمر.
- القيمة التشغيلية: قابل للتطبيق عبر أنواع الخلايا والظروف المختلفة، مما يسهل الاتساق الترجمي.
- القيمة الاستراتيجية: يتيح تقييماً معدلاً حسب المخاطر لاستراتيجيات استهداف بروتين Tau من خلال توضيح الآلية النووية.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندرج هذه الطريقة ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر حيث يتطلب التحقق من الهدف وضوحاً ميكانيكياً لوظيفة البروتين النووي، لاسيما في نماذج الأمراض التنكسية العصبية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة ببروتين Tau النووي في التنظيم النسخي، مما يقلل من الغموض الميكانيكي.
- الفحص: تتيح الحصول على أجزاء تحت خلوية جاهزة للمقايسة من أجل التقييم الكمي لتعديل الجينات المعتمد على Tau.
- التحليلات: توفر قراءات قائمة على لطخة ويسترن (Western blot) لإثراء Tau النووي والتعبير عن الجينات المستهدفة (مثل VGluT1) من أجل تحليل الظروف المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط وظيفة Tau النووي بالتعبير الجيني ذي الصلة بالمرض في النماذج العصبية، مما يدعم الاستمرارية في المرحلة ما قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تتكون من تقنيات قابلة للتطبيق على نطاق واسع، مما يسمح بإعادة استخدامها عبر دراسات Tau في سياقات خلوية متنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في الدور الوظيفي لبروتين Tau النووي، وتقليل الغموض الميكانيكي في تنظيم الجينات.
- القيمة التشغيلية: التنميط من خلال استخدام طرق كلاسيكية وموثوقة؛ وقابلية التكرار عبر ضوابط التجزئة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف عن طريق عزل التأثيرات الخاصة بالنواة، مما يقلل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من البرامج التي تستهدف بروتين Tau.
- التأثير على المحفظة: تحديد أولويات الأهداف بناءً على آلية عمل نووية مثبتة مع تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في ترانسفكشن الخلايا الثديية، والتجزئة تحت الخلوية، وتحليل Western blot.
- يعتمد على أجهزة قياسية: أجهزة الطرد المركزي، وأنظمة الفصل الكهربائي للهلام، وكاشفات التألق الكيميائي.
- يستلزم توحيد بروتوكولات التجزئة بين الفرق لضمان نقاء المقصورات الخلوية.
- قد يتطلب التكييف مع العصبونات الأولية أو النماذج الأخرى تحسين ظروف الترانسفكشن والتحلل الخلوي.
- قيد عملي: تعتمد الكفاءة على نجاح عملية الترانسفكشن والتحقق الصحيح من مؤشرات الأجزاء (على سبيل المثال، H2B و actin و tubulin).
