التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR
يوليو 29, 2019
نقدم استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR من خلال الجمع بين التعميم RT-PCR، الكمية RT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، ووصمة عار الشمالية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة تطبيع للتقليل إلى أدنى حد من تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر 5'، وهو مناسب للتمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوتشوندريون الذرة.
ويستخدم هذا البروتوكول لرسم الخرائط والتمييز في النصوص الأولية والمجهزة في الميتوكوندريا الذرة. وتشمل هذه التقنية خطوة التطبيع RNA وأنها تقلل من تأثير غير مستقر خمسة ثلاثي الفوسفات رئيس الذي يعوق تمييزا واضحا بين النصوص الأولية والمجهزة. وإلى جانب الميتوكوندريا الذرة، يمكن تطبيق هذه الطريقة على البلاستيدات والميتوكوندريا النباتية الأخرى.
ابدأ بجمع 20 غرامًا من الحبوب النامية في أنبوب 50 ملليلتر على الجليد. نقل حبات إلى مدفع هاون قبل تبريد وإضافة 10 إلى 20 ملليلتر من الجليد الباردة استخراج العازلة. طحن حبات تماما، إضافة المزيد من استخراج العازلة وتصفية الأنسجة الأرضية من خلال طبقتين من القماش تصفية.
الطرد المركزي الترشيح في 8، 000 مرة G لمدة 10 دقائق. ثم نقل فائقة إلى أنبوب جديد والتخلص من الترشيح. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 20،000 مرة G لمدة 10 دقيقة.
صب قبالة مفحم وإعادة تعليق بيليه في ستة ملليلتر من العازلة الغسيل. Aliquot التعليق في خمسة 1.5 ملليلتر أنابيب RNase خالية والطرد المركزي لهم في 14،000 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل عظمى وتجميد بيليه الميتوكوندريا في النيتروجين السائل.
استخراج الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا باستخدام الكواشف التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واقامة RNA خمسة علاج البولي فوسفاتاتاز رئيس. ثم، استرداد الجيش الملكي النيبالي مع عدة تنقية الحمض النووي الريبي. الكاشف المستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي هو خطر.
دائماً العمل معها في غطاء الدخان وارتداء دائما معطف المختبر والقفازات. إعداد اثنين من ردود الفعل التعميم باستخدام نفس الكميات من خمسة رئيس polyphosphatase المعالجة وغير المعالجة الحمض النووي الريبي الميتوكوندريا. احتضان كل من ردود الفعل في 16 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة ومن ثم استعادة الحمض النووي الريبي الذاتي مع مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المستخدمة سابقا.
ابدأ بإعداد خليط التمهيدي بنسبة مساوية لـ 26 SCRT وما يصل إلى سبعة التمهيدية أخرى للنسخ العكسي. تجميع نظامين رد فعل النسخ العكسي وفقا لاتجاهات المخطوطة واحتضانها عند 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. لتطبيع الحمض النووي، إعداد رد فعل PCR اثنين مع نفس حجم cDNA من خمسة رئيسي polyphosphatase المعالجة أو غير المعالجة RNA وتشغيل رد الفعل تحت ظروف الدراجات الحرارية الموصوفة في المخطوطة.
التطبيع من قبل 26S RRNA ناضجة هي خطوة رئيسية للتمييز بين النصوص الأولية والمجهزة. قارن وفرة من اثنين من المنتجات PCR وإذا لزم الأمر، وتحسين التطبيع عن طريق ضبط كميات من قالب cDNA. إعداد أزواج من ردود الفعل PCR مع وحدات التخزين المناسبة من cDNA تطبيع وزوج من التمهيديات المتباينة كما هو الحال في رئيس الوزراء خمسة إلى ثلاثة تقاطع رئيس من النصوص المستهدفة وأداء PCR وفقا لتوجيهات المخطوطة.
ثم، استخدم مجموعة استرجاع الحمض النووي هلام لعزل الشرائط البارزة التي يتم تضخيمها بواسطة PCR متداخلة. استنساخ هلام تنقية منتجات PCR في ناقل باستخدام التقنيات القياسية وتنفيذ PCR مستعمرة لتحديد استنساخ إيجابية تحتوي على إدراج الهدف. تسلسل منتجات PCR ومواءمة البيانات تسلسل مع الجينوم الميتوكوندريا الذرة باستخدام أداة البحث المحاذاة المحلية الأساسية أو انفجار.
اختيار الذرة الكائن الحي والبحث في جمع نووكليوتيد قاعدة البيانات. العثور على رئيس الوزراء خمسة إلى ثلاثة تقاطع رئيس الوزراء من النص المعمم وتحديد مواقف خمسة رئيس الوزراء وثلاثة نص رئيس تيرميني. تضخيم جزء الحمض النووي المستخدمة لإعداد مسبار الحمض النووي الريبي واستنساخه إلى المتجه المستخدم سابقًا والذي يحتوي على مروج T7 ، 17 زوجًا أساسيًا في المنبع لموقع الإدراج.
تسمية تحقيقات الجيش الملكي النيبالي مع حفر-11-UTP وتنفيذ التهجين RNA باستخدام مجموعات تجارية. تمييز في الغايات الأولية الخمسة الرئيسية المعالجة من خلال مقارنة منتجات RT-PCR الدائرية التي تم الحصول عليها من خمسة من البوليفوسفاتاتيز الرئيسي المعالج وغير المعالج للرنا. ثم تصميم التعديلات الكمية RT-PCR استناداً إلى نتائج رسم الخرائط والتحقق من نتائج التمييز مع RT-PCR.
وقد استُخدِم جين COX-2 كمثال لإثبات رسم خرائط وتفرقة سجلات الميتوكوندريا من الذرة من خلال الاستراتيجية الدائرية القائمة على RT-PCR. واستخدمت cDNA تطبيع كنماذج ل PCR، مما أدى إلى اثنين من العصابات البارزة تضخيم من عينة المعالجة الخمسة الرئيسي polyphosphatase. وسمي النطاقين كوكس-2 واحد واثنين تم استردادهما من الجل واستنساخهما في ناقلات.
وأظهرت نتائج PCR مستعمرة أن استنساخ إيجابية تحتوي على إدراج مع حجم متغير مما يعني أن الارميني لديها خمسة رئيس الوزراء أو ثلاثة رئيس تيرميني غير متجانسة. وأظهرت نتائج التسلسل أن COX-2 واحد واثنين لديهم نفس الغايات الرئيسية الثلاثة في 39 نوكليوتيدات المصب من كودون وقف في حين تقع التسميني الرئيسي الخمسة في 992 إلى 1، 030 و 1، 276 إلى 1، 283 النيوكليوتيدات المنبع من كودون البداية، على التوالي. تم إجراء تهجين RNA جل لطخة للتحقق من نتائج الخرائط RT-PCR التعميم واثنين من النطاقات الرئيسية مع أحجام مماثلة ل COX-2 واحد واثنين تم الكشف عن.
تم تصميم زوج آخر من ال التمهيديات المتباينة لتضخيم النطاقات الثلاث والأربعة COX-2 التي تم اكتشافها مع لطخة هلام RNA ولكن ليس مع المرة الأولى الدائري RT-PCR. أكدت النتائج الكمية RT-PCR أن COX-2 واحد واثنين وثلاثة وأربعة كانت حساسة لخمسة من البوليفوسفاتاز الرئيسي وأنهم لديهم خمسة الابتدائي الترميني الرئيسي. يمكن إجراء تحليل ملحق التمهيدي للتحقق من نتائج تعيين خمسة رئيسية على الرغم من أنه غير مضمن في هذا البروتوكول.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولاً لرسم الخرائط والتمييز بين النصوص الأولية والمعالجّة في ميتوكوندريا الذرة باستخدام إستراتيجية دائرية قائمة على RT-PCR. يشمل الأسلوب خطوة تطبيع الحمض النووي الريبي لتقليل تأثير ثلاثي فوسفات 5' غير المستقر، مما يزيد من وضوح النص.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا النبات الجزيئية
- تحليل النص
- الهندسة الوراثية
الخلفية
- فهم ديناميات النص ضروري لبيولوجيا النبات.
- تعمل ميتوكوندريا الذرة كنموذج لدراسة معالجة الحمض النووي الريبي.
- قد تواجه الطرق التقليدية صعوبات مع التعديلات غير المستقرة للحمض النووي الريبي.
- يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين الدقة في رسم خرائط النص.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لتمييز بين النصوص الأولية والمعالجّة.
- تعزيز فهم استقرار الحمض النووي الريبي في ميتوكوندريا الذرة.
- توفير بروتوكول يمكن تطبيقه على عضيات نباتية أخرى.
الطرق المستخدمة
- RT-PCR الدائري لتضخيم النص.
- RT-PCR الكمي لقياس مستويات النص.
- علاج RNA 5' polyphosphatase لتثبيت الحمض النووي الريبي.
- التنسيم الشمالي لتصور نصوص الحمض النووي الريبي.
النتائج الرئيسية
- ينجح البروتوكول في التمييز بين أنواع النص.
- تقلل خطوات التطبيع بشكل كبير من التباين.
- تشير النتائج إلى تطبيقات محتملة تتجاوز ميتوكوندريا الذرة.
- الأسلوب قابل للتكرار وموثوق لتحليل النص.
الاستنتاجات
- يقدم هذا البروتوكول نهجًا قويًا لرسم خرائط النص.
- يعالج التحديات التي تسببها التعديلات غير المستقرة للحمض النووي الريبي.
- يمكن للدراسات المستقبلية توسيع نطاق تطبيقه إلى أنظمة نباتية أخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Accurate discrimination and mapping of primary versus processed mitochondrial transcripts in maize enables mechanistic de-risking and target validation in plant molecular biology pipelines. The circular RT-PCR-based strategy, with RNA normalization, addresses instability of 5' triphosphate ends, supporting reproducible transcript endpoint identification. This capability enhances predictive confidence for downstream functional genomics and assay development in plant biotechnology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise mapping of transcript initiation and processing sites for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing transcriptional from post-transcriptional RNA species.
- Improves predictive confidence in gene expression studies relevant to mitochondrial function.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA templates for downstream quantitative assays.
- Standardizes transcript discrimination, supporting reproducibility and assay comparability.
- Enables robust detection of transcript variants for screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcript mapping with disease-relevant mitochondrial models in plant systems.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of mitochondrial gene function.
- Supports risk-adjusted advancement of mitochondrial targets in plant biotechnology pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This circular RT-PCR-based method integrates into the discovery-to-validation continuum for plant mitochondrial transcriptomics, supporting both early mechanistic studies and downstream assay development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on transcript origin and processing in mitochondrial gene regulation.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for transcript variant detection.
- Analytics: Delivers precise mapping and quantification of transcript termini for comparative analyses.
- Translational Research: Supports alignment of transcriptomic data with functional mitochondrial models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to other plant organelles and species, as supported by the protocol.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in transcript mapping.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of transcript discrimination workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for mitochondrial gene targets and supports capital-efficient R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial and organellar targets in plant biotechnology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA extraction, enzymatic treatment, and molecular cloning.
- Needs access to RT-PCR, quantitative PCR, and Northern blot instrumentation.
- Demands rigorous normalization and cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation to other plant organelles or species may require protocol optimization.
- Some transcript patterns may remain unresolved due to biological complexity, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Preparation of Crude Mitochondrion from Maize Developing Kernels
1:45
RNA 5’ Polyphosphatase Treatment and Circularization
2:33
Reverse Transcription and Normalization
3:30
PCR Amplification and Determination of Transcript Termini
4:34
Verification of the cRT-PCR Mapping Results by RNA Gel Blot Hybridization
5:00
Discrimination of Primary and Processed 5’ Ends
5:26
Determination of Maize mRNA Termini Using the Circular RT-PCR-based Strategy
7:05
Conclusion
