القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

يستخدم الترسيب المناعي المتعدد الكمية (QMI) قياس التدفق الخلوي للكشف الحساس عن الاختلافات في وفرة التفاعلات المستهدفة بين البروتين والبروتين بين عينتين. يمكن إجراء QMI باستخدام كمية صغيرة من المواد الحيوية، ولا يتطلب علامات هندسية وراثيا، ويمكن تكييفها لأي شبكة تفاعل البروتين المحددة سابقا.

يمكّن التشبيك المناعي المشترك المضاعف الكمي، أو QMI، المستخدمين من قياس المئات من التفاعلات الثنائية في شبكة تفاعل البروتين المحددة مسبقًا في وقت واحد. من خلال تنفيذ متعددة شارك في IPs في وقت واحد في نفس lysate ، تقنيات المعلوماتية الحيوية يمكن ثم دراسة كيفية تغيير مجموعات من الجمعيات المشتركة بطريقة منسقة. المقايسة تستغرق وقتا طويلا لتطوير، ولكن مرة واحدة لوحة QMI هو في متناول اليد يمكن جمع بيانات نطاق الشبكة حول أنظمة نقل الإشارات في مجرد إجراء تحليل بين عشية وضحاها نسبيا.

يتطلب مؤشر قطر قطر لميكون الألواح الدقيق للعينات والكواشف المختلفة في 96 صحن بئر. وينبغي أن تؤخذ الملاحظات الدقيقة عند إعداد وتشغيل كل مُقيّم لمنع الأخطاء. لإعداد العينات والمناعة ، ابدأ من خلال وضع العينة في منظفات مناسبة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتاز لاحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.

في نهاية الحضانة، تدور أسفل العينة لإزالة الأغشية والحطام وإجراء اختبار BCA على اابر لتحديد تركيز البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد تطبيع تركيزات البروتين، إعداد مزيج سيد حبة المغناطيسي الذي يحتوي على ما يقرب من 250 الخرز المغناطيسي من كل فئة في البئر. استخدام فصل المغناطيسي لغسل مزيج حبة المغناطيسي مرتين في Fly P العازلة قبل resuspending الخرز في 20 ميكرولترات من يطير P العازلة لكل عينة.

بعد pipetting شامل، aliquot 20 ميكرولترات من الخرز في أنبوب صغير مركز الجليد الجليد واحد لكل عينة وإضافة كميات متساوية من lysate مع تركيزات البروتين تطبيع لكل أنبوب للمناعة. ثم تقسيم كل عينة lysate إلى أنبوب واحد لكل لوحة يجري تشغيلها ومناعةcipitate العينات على دوار في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي استخدام رف الخرز المغناطيسي لإزالة lysate من المجموعة الأولى من الأنابيب وغسل الخرز مرتين في 500 ميكروليتر من الجليد الباردة يطير P العازلة في غسل.

بعد حساب حجم resuspension ، resuspend مناعية في حجم محسوبة الجليد الباردة ذبابة P العازلة. resuspend بدقة الخرز المغناطيسي عن طريق pipetting لطيف وتوزيع 25 ميكرولترات من الخرز في بئر عبر مسطحة القاع 96 لوحة جيدا على الجليد. في لوحة مختلفة 96 جيدا، تمييع بواسطة الأجسام المضادة التحقيق attinilated إلى تركيز العمل مرتين.

استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 25 ميكرولترات من كل مسبار التخفيف من الأجسام المضادة في الآبار المناسبة من حبة المغناطيسية التي تحتوي على لوحة المقايسة ويهز بسرعة عالية على لوحة أفقية شاكر لخلط و resuspend الخرز المغناطيسي. بعد الاختلاط، والحد من سرعة لاحتضان ساعة واحدة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع الطازجة ذبابة P العازلة لكل غسل على غسالة لوحة المغناطيسي في أربع درجات مئوية.

بعد الغسيل الأخير ، resuspend الخرز في 50 ميكرولترات من streptavidin PE المخفف واحد إلى 200 في فلاي بي العازلة. يهز المزيج وإعادة بناء الخرز قبل احتضان لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع يطير P العازلة على غسالة لوحة مغناطيسية في أربع درجات مئوية وإعادة ربط الخرز في 125 ميكروليترس من ذبابة P العازلة.

يهز لوحة لمدة دقيقة واحدة في 900 التناوب لإعادة توزيع جيدا الخرز وتحميل لوحة في عداد المقاييس تدفق refridgerated. في برنامج مقياس التدفق، حدد إعداد الهدف RP1 High، وحالة توقف 1000 حبة لكل منطقة، وحجم عينة من 80 ميكرولترات. وقفة تشغيل في منتصف الطريق من خلال وإعادة تعليق الخرز لمنع الاستقرار.

في نهاية التشغيل، تصدير ملفات البيانات في تنسيق XML. لإجراء تحليل ANC ، قم بملء ملف الإدخال الخاص بـ ANC ليعكس تفاصيل التصميم التجريبي وتشغيل البرنامج ، والذي سيكتب ملف CSV في الدليل النشط. الملف الذي ينتهي بـ مرات الدخول.

سيُبلغ csv عن الارتباطات المشتركة للبروتين التي تختلف بشكل كبير عند مستوى إيجابي زائف يبلغ 0.05 بين ظروف التحكم والتجريبية في ثلاثة على الأقل من أربعة نسخ تجريبية. لتحليل شبكة الارتباط المرجح، قم بلصق عناوين الأعمدة الخاصة بإخراج ملف البيانات بواسطة Matlab الذي ينتهي بالملف mfi. csv في العمود الأول من جدول بيانات جديد وإضافة أعمدة تجربة للتجربة رقم والعلاج للعلاج التجريبي وأي متغيرات أخرى لتحليلها.

حفظ هذا الملف كـ سمات. csv وفتح R ستوديو. تعيين دليل العمل إلى مجلد يحتوي على mfi.

csv والسمات. CSV ملفات تمييز المقاطع من التعليمات البرمجية، وضرب الأوامر أدخل لتشغيل الأوامر R كما هو مبين في ملف الأوامر المعلقة. وحدات تحليل شبكة الارتباط المرجح المرتبطة بشكل كبير مع كل سمة تجريبية سوف يكون الإخراج كملف رسومية والارتباط من كل تفاعل مع كل وحدة سوف يكون الإخراج كملف CSV.

لكل تفاعل في ملف إخراج ANC، تحديد ما إذا كان هذا التفاعل هو أيضا كبيرة من قبل CNA وإنشاء عمود جديد يشير إلى ما إذا كان كل ضربة ANC هو أيضا ضرب CNA. تحويل القيم إلى تسجيل تغيير أضعاف اثنين وحساب متوسط قيمة كافة الزيارات CNA الاتحاد ANC. وأخيراً، قم بعمل جدول بيانات جديد مع كل اتحاد من اتحادات ANC تم إدراجه في العمود الثالث من قبل هدف المناعة في عمود واحد، وهدفه في العمود الثاني، وقيمة تغييره الطي في العمود الثالث.

استيراد هذا الملف إلى Cytoscape كشبكة لإنشاء مخطط حافة عقدة. يتم تصور تفاعلات البروتين عالية الثقة التي حددها النهجان الإحصائيان المستقلان على أنها مخططات حافة العقدة باستخدام برنامج المصدر المفتوح ، Cytoscape ، أو كخرائط heatmap باستخدام رمز R وتعليمات التحليل المضمنة في المواد التكميلية. طوال البروتوكول ، يحتاج المستخدمون إلى توخي الحذر من الماصات بدقة ، للحفاظ على سجلات دقيقة ، والحفاظ على العينات باردة في جميع الأوقات.

لقد استخدمنا QMI لفهم كيفية التفريق بين مسارات تحويل الإشارات بين أنواع الإدخال المختلفة ودمج المعلومات من مستقبلات متعددة.