القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد
August 21st, 2019
يستخدم الترسيب المناعي المتعدد الكمية (QMI) قياس التدفق الخلوي للكشف الحساس عن الاختلافات في وفرة التفاعلات المستهدفة بين البروتين والبروتين بين عينتين. يمكن إجراء QMI باستخدام كمية صغيرة من المواد الحيوية، ولا يتطلب علامات هندسية وراثيا، ويمكن تكييفها لأي شبكة تفاعل البروتين المحددة سابقا.
يمكّن التشبيك المناعي المشترك المضاعف الكمي، أو QMI، المستخدمين من قياس المئات من التفاعلات الثنائية في شبكة تفاعل البروتين المحددة مسبقًا في وقت واحد. من خلال تنفيذ متعددة شارك في IPs في وقت واحد في نفس lysate ، تقنيات المعلوماتية الحيوية يمكن ثم دراسة كيفية تغيير مجموعات من الجمعيات المشتركة بطريقة منسقة. المقايسة تستغرق وقتا طويلا لتطوير، ولكن مرة واحدة لوحة QMI هو في متناول اليد يمكن جمع بيانات نطاق الشبكة حول أنظمة نقل الإشارات في مجرد إجراء تحليل بين عشية وضحاها نسبيا.
يتطلب مؤشر قطر قطر لميكون الألواح الدقيق للعينات والكواشف المختلفة في 96 صحن بئر. وينبغي أن تؤخذ الملاحظات الدقيقة عند إعداد وتشغيل كل مُقيّم لمنع الأخطاء. لإعداد العينات والمناعة ، ابدأ من خلال وضع العينة في منظفات مناسبة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتاز لاحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
في نهاية الحضانة، تدور أسفل العينة لإزالة الأغشية والحطام وإجراء اختبار BCA على اابر لتحديد تركيز البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد تطبيع تركيزات البروتين، إعداد مزيج سيد حبة المغناطيسي الذي يحتوي على ما يقرب من 250 الخرز المغناطيسي من كل فئة في البئر. استخدام فصل المغناطيسي لغسل مزيج حبة المغناطيسي مرتين في Fly P العازلة قبل resuspending الخرز في 20 ميكرولترات من يطير P العازلة لكل عينة.
بعد pipetting شامل، aliquot 20 ميكرولترات من الخرز في أنبوب صغير مركز الجليد الجليد واحد لكل عينة وإضافة كميات متساوية من lysate مع تركيزات البروتين تطبيع لكل أنبوب للمناعة. ثم تقسيم كل عينة lysate إلى أنبوب واحد لكل لوحة يجري تشغيلها ومناعةcipitate العينات على دوار في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي استخدام رف الخرز المغناطيسي لإزالة lysate من المجموعة الأولى من الأنابيب وغسل الخرز مرتين في 500 ميكروليتر من الجليد الباردة يطير P العازلة في غسل.
بعد حساب حجم resuspension ، resuspend مناعية في حجم محسوبة الجليد الباردة ذبابة P العازلة. resuspend بدقة الخرز المغناطيسي عن طريق pipetting لطيف وتوزيع 25 ميكرولترات من الخرز في بئر عبر مسطحة القاع 96 لوحة جيدا على الجليد. في لوحة مختلفة 96 جيدا، تمييع بواسطة الأجسام المضادة التحقيق attinilated إلى تركيز العمل مرتين.
استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 25 ميكرولترات من كل مسبار التخفيف من الأجسام المضادة في الآبار المناسبة من حبة المغناطيسية التي تحتوي على لوحة المقايسة ويهز بسرعة عالية على لوحة أفقية شاكر لخلط و resuspend الخرز المغناطيسي. بعد الاختلاط، والحد من سرعة لاحتضان ساعة واحدة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع الطازجة ذبابة P العازلة لكل غسل على غسالة لوحة المغناطيسي في أربع درجات مئوية.
بعد الغسيل الأخير ، resuspend الخرز في 50 ميكرولترات من streptavidin PE المخفف واحد إلى 200 في فلاي بي العازلة. يهز المزيج وإعادة بناء الخرز قبل احتضان لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة ثلاث مرات مع يطير P العازلة على غسالة لوحة مغناطيسية في أربع درجات مئوية وإعادة ربط الخرز في 125 ميكروليترس من ذبابة P العازلة.
يهز لوحة لمدة دقيقة واحدة في 900 التناوب لإعادة توزيع جيدا الخرز وتحميل لوحة في عداد المقاييس تدفق refridgerated. في برنامج مقياس التدفق، حدد إعداد الهدف RP1 High، وحالة توقف 1000 حبة لكل منطقة، وحجم عينة من 80 ميكرولترات. وقفة تشغيل في منتصف الطريق من خلال وإعادة تعليق الخرز لمنع الاستقرار.
في نهاية التشغيل، تصدير ملفات البيانات في تنسيق XML. لإجراء تحليل ANC ، قم بملء ملف الإدخال الخاص بـ ANC ليعكس تفاصيل التصميم التجريبي وتشغيل البرنامج ، والذي سيكتب ملف CSV في الدليل النشط. الملف الذي ينتهي بـ مرات الدخول.
سيُبلغ csv عن الارتباطات المشتركة للبروتين التي تختلف بشكل كبير عند مستوى إيجابي زائف يبلغ 0.05 بين ظروف التحكم والتجريبية في ثلاثة على الأقل من أربعة نسخ تجريبية. لتحليل شبكة الارتباط المرجح، قم بلصق عناوين الأعمدة الخاصة بإخراج ملف البيانات بواسطة Matlab الذي ينتهي بالملف mfi. csv في العمود الأول من جدول بيانات جديد وإضافة أعمدة تجربة للتجربة رقم والعلاج للعلاج التجريبي وأي متغيرات أخرى لتحليلها.
حفظ هذا الملف كـ سمات. csv وفتح R ستوديو. تعيين دليل العمل إلى مجلد يحتوي على mfi.
csv والسمات. CSV ملفات تمييز المقاطع من التعليمات البرمجية، وضرب الأوامر أدخل لتشغيل الأوامر R كما هو مبين في ملف الأوامر المعلقة. وحدات تحليل شبكة الارتباط المرجح المرتبطة بشكل كبير مع كل سمة تجريبية سوف يكون الإخراج كملف رسومية والارتباط من كل تفاعل مع كل وحدة سوف يكون الإخراج كملف CSV.
لكل تفاعل في ملف إخراج ANC، تحديد ما إذا كان هذا التفاعل هو أيضا كبيرة من قبل CNA وإنشاء عمود جديد يشير إلى ما إذا كان كل ضربة ANC هو أيضا ضرب CNA. تحويل القيم إلى تسجيل تغيير أضعاف اثنين وحساب متوسط قيمة كافة الزيارات CNA الاتحاد ANC. وأخيراً، قم بعمل جدول بيانات جديد مع كل اتحاد من اتحادات ANC تم إدراجه في العمود الثالث من قبل هدف المناعة في عمود واحد، وهدفه في العمود الثاني، وقيمة تغييره الطي في العمود الثالث.
استيراد هذا الملف إلى Cytoscape كشبكة لإنشاء مخطط حافة عقدة. يتم تصور تفاعلات البروتين عالية الثقة التي حددها النهجان الإحصائيان المستقلان على أنها مخططات حافة العقدة باستخدام برنامج المصدر المفتوح ، Cytoscape ، أو كخرائط heatmap باستخدام رمز R وتعليمات التحليل المضمنة في المواد التكميلية. طوال البروتوكول ، يحتاج المستخدمون إلى توخي الحذر من الماصات بدقة ، للحفاظ على سجلات دقيقة ، والحفاظ على العينات باردة في جميع الأوقات.
لقد استخدمنا QMI لفهم كيفية التفريق بين مسارات تحويل الإشارات بين أنواع الإدخال المختلفة ودمج المعلومات من مستقبلات متعددة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
الموجز
يُمكّن الترسيب المناعي المتعدد الكمي (QMI) من القياس المتزامن للعديد من تفاعلات البروتين-البروتين داخل شبكة محددة. هذه الطريقة فعالة، ولا تتطلب إلا الحد الأدنى من المواد الحيوية ولا تتطلب علامات معدلة وراثيًا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- يُمكّن QMI اكتشاف الاختلافات في تفاعلات البروتين بين العينات.
- يمكن تعديل الاختبار للعديد من شبكات تفاعل البروتين.
- يسمح بجمع بيانات على نطاق الشبكة حول أنظمة نقل الإشارة.
- تعتبر التخفيف الدقيق والإعداد ضروريين لتجنب الأخطاء.
هدف الدراسة
- لقياس التفاعلات الثنائية في شبكات البروتين.
- لتحليل كيفية تغير الارتباطات المشتركة بطريقة منسقة.
- لتطوير اختبار موثوق لدراسة الأنظمة البيولوجية المعقدة.
الطرق المستخدمة
- الترسب المناعي المتزامن في لوحات 96 بئرًا.
- تفتيت العينات باستخدام منظفات مناسبة مع مثبطات.
- تقنيات المعلومات الحيوية لتحليل البيانات.
- اختبارات ليلية لجمع البيانات.
النتائج الرئيسية
- يوفر QMI اكتشافًا حساسًا لتفاعلات البروتين.
- يسهل دراسة مسارات الإشارات المعقدة.
- يمكن التحليل عالي الإنتاجية لشبكات البروتين.
- يظهر فعالية التعددية في الترسيب المناعي.
الاستنتاجات
- QMI هو أداة قوية لدراسة تفاعلات البروتين.
- يبسط عملية تحليل البيانات البيولوجية المعقدة.
- قد تتسع التطبيقات المستقبلية للعديد من مجالات البحث.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) enables biopharma R&D teams to simultaneously measure hundreds of binary protein interactions within a defined network, providing network-scale insights into signal transduction dynamics. By eliminating the need for genetic tagging and requiring minimal biomaterial, QMI supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery workflows. The method generates quantitative fold-change data that can be analyzed using independent statistical approaches (ANC and WGCNA) to increase predictive confidence in protein co-associations relevant to therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fold changes in protein interactions across experimental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation without genetic manipulation, preserving native protein complexes.
- Predictive Value: Increases confidence in target selection through coordinated changes in co-associations detected by dual statistical validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative, fluorescence-based readouts of Proteins in Shared Complexes (PiSCES) for reproducible interaction profiling.
- Operational Value: Uses MagBead spectral regions to multiplex immunoprecipitations, enabling parallel processing in 96-well format.
- Scalability Value: Adaptable to any defined protein interaction network, supporting reuse across projects and model systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Generates hypothesis-ready data from T cell and neuronal glutamate synapse networks, with direct relevance to immune and neurological disease areas.
- Mechanistic De-risking: Identifies condition-specific interaction changes that inform pathway modulation strategies.
- Preclinical Continuity: Outputs node-edge diagrams and heatmaps that visualize high-confidence interactions for downstream validation.
Pipeline & Workflow Integration
QMI fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization, providing interaction network context that informs compound mechanism of action and selectivity profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how groups of co-associations change in response to stimuli or perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative interaction data suitable for hit confirmation and pathway elucidation.
- Analytics: Enables comparison of interaction strengths via log2 fold change and statistical significance (FDR < 0.05) across replicates.
- Translational Research: Connects discovery-phase interaction dynamics to disease-relevant systems such as immune synapses and neuronal signaling.
- Enterprise Reuse: Once developed, the QMI panel allows repeated overnight assays, reducing per-experiment time and reagent burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through quantitative, multiplexed interaction measurements.
- Operational Value: Standardizes complex co-IP workflows using magnetic bead separation and flow cytometry readout.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by de-risking mechanistic assumptions early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on network-level interaction dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody validation, magnetic bead handling, and flow cytometry optimization.
- Dependent on access to a refrigerated flow cytometer capable of multiplexed bead region detection.
- Necessitates standardized lysis buffer optimization and careful protein normalization across samples.
- Involves multi-day assay development including antibody screening, bead conjugation, and probe biotinylation.
- Limited to soluble protein complexes; may not capture transient or membrane-embedded interactions without optimization.
