Name: تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2-O-Methyl (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: اكتشف بروتوكول تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي الصغير ذو التحيز المنخفض والحساسية العالية لكشف RNAs 2'-O-Methyl. يوفر هذا الأسلوب مرونة استخدام المواد المحلية أو التجارية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد دعم هذا العمل المركز الوطني للبحوث العلمية، واللجنة الفرنسية للطاقات البديلة والطاقة الذرية، وجامعة باريس - سود. وقد أجريت جميع عمليات إعداد المكتبة وتسلسل إلومينا وتحليلات المعلوماتية الحيوية لهذه الدراسة في مرفق التسلسل من الجيل التالي من الـ I2BC. ويُعترف بأعضاء مرفق I2BC NGS للقراءة النقدية للمخطوطة والاقتراحات المفيدة.

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing%3A+implications+of+enzymatic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li>
<li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4(2012).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141(2011).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%27-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54(2012).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049(2015).</li>
<li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118(2018).</li>
<li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969(2011).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li>
<li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619(2014).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109(2013).</li>
<li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105(2018).</li>
<li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41(2012).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009(2016).</li>
</ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

إعداد مكتبة RNA الصغيرة لا يزال تحديا بسبب التحيز، التي أدخلت أساسا خلال خطوات ربط محول. RNAs مع تعديل 2'-OMe في نهايتها 3 'مثل miRNAs النبات، piRNA في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA) في الحشرات والنباتات من الصعب بشكل خاص لدراسة لأن تعديل 2'-OMe يمنع ربط محول 3'. وقد اقتُرح عدد من الحلول في المؤلفات لتحسين بروتوكولات إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي، ولكن معظم المجموعات المتاحة تجارياً لا تزال تستند إلى بروتوكول TS التقليدي، الذي تنطوي على تحيز شديد. وهناك عدد قليل من مجموعات 'التحيز منخف...

وتشارك التقييمات RNSالصغيرة (sRNAs) في مراقبة تنوع العمليات البيولوجية1. عادة ما يتراوح حجم الـ sRNAs التنظيمية Eukaryotic بين 20 و30 nt؛ الأنواع الرئيسية الثلاثة هي microRNAs (ميرنا)، RNAs piwi التفاعل (بيرنا) وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA). وقد تورطت مستويات التعبير ميرنا Aberrant في مجموعة متنوعة من الأمراض2. وهذا يؤكد أهمية miRNAs في الصحة والمرض والحاجة إلى أدوات بحث دقيقة وكمية للكشف عن sRNAs بشكل عام.
الجيل التالي من التسلسل (NGS) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة sRNAs. المزايا الرئيسية للـ NGS بالمقارنة مع النُهج الأخرى، مثل تقنيات PCR الكمية أو المصفوفة الدقيقة (qPCR)، هي أنها لا تحتاج إلى معرفة مسبقة بتسلسلات الحمض النووي الريبي، وبالتالي يمكن استخدامها لاكتشاف RNAs جديدة، وبالإضافة إلى ذلك فإنه يعاني من أقل من إشارة الخلفية وتأثيرات التشبع. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن الكشف عن الاختلافات النيوكليوتيد واحد ولها الإنتاجية أعلى من المصفوفات الدقيقة. ومع ذلك، فإن المنظمات غير الحكومية لديها أيضا بعض العيوب؛ تظل تكلفة تشغيل التسلسل مرتفعة نسبياً وقد تؤدي عملية الخطوات المتعددة المطلوبة لتحويل عينة إلى مكتبة للتسلسل إلى تحيزات. في عملية إعداد مكتبة sRNA نموذجية، يتم ربط محول 3 ' أولاً إلى sRNA (غالباً ما يتم تنقية هلام من إجمالي RNA) باستخدام نسخة مقتطعة من RNA ligase 2 (RNL2) ومحول preadenylated 3 ' (الشكل 1) في غياب ATP. وهذا يزيد من كفاءة الربط محول sRNA ويقلل من تشكيل ردود الفعل الجانبية مثل التعميم sRNA أو التعام. في وقت لاحق، يتم ربط محول 5 'بواسطة RNA ligase 1 (RNL1)، تليها النسخ العكسي (RT) وتضخيم PCR. كل هذه الخطوات قد إدخال التحيز3،4. وبالتالي، قد لا تعكس أرقام القراءة مستويات التعبير sRNA الفعلية مما يؤدي إلى أنماط التعبير الاصطناعية المعتمدة على الأسلوب. قد تكون sRNAs محددة إما ممثلة تمثيلاً زائداً أو ناقصاً في مكتبة، وقد تهرب sRNAs الممثلة تمثيلاً ناقصاً بشدة من الكشف. الوضع معقد بشكل خاص مع الميرنات النباتية، سيرنا في الحشرات والنباتات، وpiRNAs في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، والتي النيوكليوتيد الطرفية 3 لديها 2'-O-ميثيل (2'-OMe) تعديل1. هذا التعديل يمنع بشدة 3 'ربط محول5،مما يجعل إعداد المكتبة لهذه الأنواع من RNA مهمة صعبة.
العمل السابق أظهر أن ربط محول يدخل التحيز خطيرة،وذلك بسبب آثار تسلسل RNA / هيكل6،7،8،9،10،11. خطوات المصب من ربط محول مثل النسخ العكسي وPCRلا تسهم بشكل كبير في التحيز6،11،12. التحيز الربط من المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أن جزيئات محول مع تسلسل معين سوف تتفاعل مع جزيئات sRNA في خليط التفاعل لتشكيل طيات مشتركة، التي قد تؤدي إما إلى تكوينات مواتية أو غير مواتية للربط(الشكل 2). وتشير البيانات الواردة من Sorefan وآخرون7 إلى أن RNL1 يفضل سياق واحد تقطعت بهم السبل، في حين أن RNL2 يفضل حبلا مزدوجة للربط. حقيقة أن يتم تحديد بنيات المحول/sRNA القابلة للطي بواسطة المحول المحدد وتسلسلات sRNA يفسر لماذا sRNA معينة هي الإفراط أو التمثيل الناقص مع مجموعة محول معينة. من المهم أيضاً ملاحظة أنه ضمن سلسلة من مكتبات sRNA لمقارنتها، يجب استخدام نفس تسلسلات المحول. في الواقع، وقد لوحظ سابقا أن تغيير المحولات عن طريق إدخال تسلسل الباركود مختلفة يغير ملامح ميرنا في تسلسل المكتبات9،13.
من المحتمل أن يؤدي عشوائية تسلسلات المحول بالقرب من تقاطع الربط إلى تقليل هذه التحيزات. Sorefan وزملاؤه7 تستخدم محولات مع 4 النيوكليوتيدات العشوائية في أطرافها، وعينت "عالية الوضوح" (HD) محولات، وأظهرت أن استخدام هذه المحولات يؤدي إلى المكتبات التي تعكس بشكل أفضل مستويات التعبير sRNA صحيح. وأكد عمل أحدث هذه الملاحظات وكشف أن المنطقة العشوائية لا تحتاج إلى أن تكون مجاورة لتقاطع الربط11. تم تسمية هذا النوع الجديد من المحولات محولات "MidRand". معاً، توضح هذه النتائج أن تصميم المحول المحسّن يمكن أن يقلل من التحيز.
بدلاً من تعديل المحولات، يمكن منع التحيز من خلال تحسين ظروف رد الفعل. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، وهو عامل الازدحام الجزيئي الكلي المعروف لزيادة كفاءة الربط14، وقد ثبت للحد بشكل كبير من التحيز15،16. واستنادا إلى هذه النتائج، ظهرت عدة مجموعات "التحيز المنخفض" في السوق. وتشمل هذه المجموعات التي تستخدم PEG في ردود الفعل الربط، إما في تركيبة مع محولات الكلاسيكية أو محولات HD. مجموعات أخرى تجنب الربط تماما، واستخدام 3 'polyadenylation والتبديل قالب ل3 'و 5' إضافة محول، على التوالي12. في استراتيجية أخرى، يتبع ربط محول 3 'خطوة التعميم، وبالتالي حذف 5 ' ربط محول17.
في دراسة سابقة، بحثنا عن بروتوكول إعداد مكتبة sRNA مع أدنى مستويات ممكنة من التحيز وأفضل الكشف عن 2'-OMe RNAs12. اختبرنا بعض مجموعات "التحيز المنخفض" المذكورة أعلاه، والتي كان الكشف عن هادىر 2'-OMe RNAs أفضل من البروتوكول القياسي (TS). ولكن من المستغرب، على تعديل (استخدام محولات معشاة، PEG في ردود الفعل الربط وإزالة محول الزائدة 3 'عن طريق تنقية) هذا الأخير تفوق البروتوكولات الأخرى للكشف عن RNAs 2'-OMe. هنا، ونحن نصف بالتفصيل بروتوكول يستند إلى بروتوكول TS، 'TS5'، الذي كان أفضل الكشف العام من RNAs 2'-OMe. ويمكن اتباع البروتوكول باستخدام الكواشف من مجموعة TS وكاشف واحد من مجموعة 'Nf' أو، لتوفير المال، وذلك باستخدام الكواشف محلية الصنع، مع أداء متساو. كما نقدم بروتوكول مفصل لتنقية sRNA من الجيش الملكي النيبالي الكلي وإعداد محول 3 'preadenylated.

<table><tbody><tr><td>2100 أداة محلل حيوي &nbsp ؛</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol: الكلوروفورم ، درجة الحموضة 4.5 (مع IAA ، 125: 24: 1)</td> <td>ThermoFisher</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)</td> <td>Nex England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP الخرز</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer Small RNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1548</td><td></td></tr><tr><td>مرشحات أنبوب الطرد المركزي Corning Costar Spin-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8162-96EA</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader transilluminator</td><td>مختلف الإمدادات</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStart PCR Kit ، مع dNTPs</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-5132-05</td><td>اختياري</td></tr><tr><td>Novex TBE المواد الهلامية 6٪</td> <td>ThermoFisher</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex TBE المواد الهلامية اليوريا 15٪</td> <td>ThermoFisher</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>Qiagen & nbsp ؛</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>كيوبت 4 مجموعة كاتب الكمية</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33227</td><td></td></tr><tr><td>كيوبيت ssDNA مجموعة الفحص</td><td>ThermoFisher</td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>صبغة تحميل هلام الحمض النووي الريبي (2X)</td> <td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr> RNA <tr><td>هلام تحميل صبغة (2X)</td> <td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor, Murine&nbsp;</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher</td><td>18090200</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Gel Stain</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td> <td>Nex England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2 ، مقتطعة</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0242S</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 50 bp DNA سلم</td><td>ThermoFisher</td><td>10488043</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012/24/36/48</td><td>اختياري</td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Glycogen ThermoFisher</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock خلية صغيرة</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock خلية صغيرة</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ZR سلم الحمض النووي الريبي الصغير</td><td>Zymo Research</td><td>R1090</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4"> يتوافق الرقمان الأخيران مع مجموعة الفهارس</td></tr></tbody></table>

تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من rnas 2'-o-methyl

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

وتتحدى قضايا التحيز أثناء إعداد المكتبة دراسة التقارير RNSالصغيرة (sRNAs) من قبل الجيل التالي من التسلسل. عدة أنواع من الحمض النووي الريبي مثل microRNAs النباتية (miRNAs) تحمل تعديل 2'-O-ميثيل (2'-OMe) في النيوكليوتيد اتّحدى 3. يضيف هذا التعديل صعوبة أخرى لأنه يمنع ربط المحول 3'. لقد أثبتنا في السابق أن الإصدارات المعدلة من بروتوكول 'TruSeq (TS)' لها تحيز أقل وأحدث تية محسنة لـ RNAs 2'-OMe. هنا نقوم بوصف بالتفصيل بروتوكول 'TS5'، الذي أظهر أفضل أداء عام. TS5 يمكن اتباعها إما باستخدام الكواشف محلية الصنع أو الكواشف من مجموعة TS، مع أداء متساو.

الخطوات الحاسمة هي عزل جزء RNA الصغيرة من المواد RNA مجموع البداية (الشكل 3) والمنتج المكتبة النهائية المطلوب (الشكل 4). كلا الخطوات تنطوي على تنقية هلام بوليأكريلاميد; يتم عزل الحمض النووي الريبي الصغيرة من 15٪ TBE هلام اليوريا، في حين يتم عزل المكتبات النهائية من 6٪ هلام TBE الأصلي. يمكن تحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة المعزولة من هلام على رقاقة صغيرة RNA الكهربائي الشعرية(جدول المواد; الشكل 3 B).</stron...

نقدم بروتوكول تعويض مكتبة RNA صغيرة مفصلة مع تحيز أقل من الأساليب القياسية وزيادة الحساسية لRNAs 2'-O-methyl. ويمكن اتباع هذا البروتوكول باستخدام الكواشف محلية الصنع لتوفير التكلفة أو استخدام مجموعات للراحة.

تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

RNA صغيرة تنظيم العديد من العمليات البيولوجية. ولذلك من المهم تطوير أساليب حساسة وغير متحيزة للكشف عنها. ويوفر بروتوكولنا خطوات إلى الأمام نحو تحقيق هذا الهدف.بروتوكولنا يعاني من قضايا التحيز أقل، من الطرق التقليدية الصغيرة RNA مكتبة الاعتماد، والأهم من ذلك أنه يسمح للكشف أكثر حساسية من شقين أو meso-RNAs. مثل النباتات الصغيرة RNAs. بعد استخراج RNA مجموع وفقا للبروتوكولات القياسية.تشغيل ما قبل 15٪ من هلام اليوريا TBE لمدة خمسة عشر دقيقة في 200 فولت. وخلط خمسة إلى عشرين ميكروغرام من مجموع RNA، في حجم ميكرولتر خمسة إلى خمسة عشر، مع حجم متساو من صبغة تحميل الفورماميد في أنبوب ميكرولتر 200. بعد خمس دقائق في 65 درجة مئوية، في دراجة الحرارة مع غطاء ساخن، ووضع الأنابيب فورا على الجليد وتحميل هذا الأخير وعينة على هلام مع حارة واحدة على الأقل بينهما.ثم تشغيل الجل في 200 فولت حتى بروموفينول قد هاجرت حوالي ثلثي طول الجل. لتحميل الجيش الملكي النيبالي، ثقب أول الجزء السفلي من نواة حرة 0.5 ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الجزئي، مع إبرة قياس 21، ووضع أنبوب ثقب في نواة جولة حرة أسفل اثنين ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الصغير. بعد ذلك ، احتضان الجل في درجة حرارة الغرفة مع وصمة هلام حمض نووي في الماء لمدة عشر إلى خمس عشرة دقيقة ، قبل عرض الجل على transilluminator.قطع عينة RNA بين 17 و 29 نطاق سلم النيوكليوتيدات، ونقل قطعة هلام في أنبوب ثقب. تدور أسفل هلام في جهاز طرد مركزي صغير في أقصى سرعة لمدة دقيقتين، وإزالة أنبوب 0.5 ملليلتر التي ينبغي أن تكون فارغة الآن. إضافة 300 ميكرولترات من النوى الحرة 0.3 ظروس كلوريد الصوديوم إلى هلام سحقت، ووضع الأنبوب على دوار لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.في نهاية نهاية الحضانة، نقل قطع هلام سحقت تعليق إلى عمود تدور، والطرد المركزي لمدة دقيقتين في السرعة القصوى في أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. ل غير اللوين ثلاثة إزالة محول رئيس، مزيج دقيق عشرة microliters نواة المياه الحرة مع عينة الحمض النووي الريبي المستخرجة، وإضافة ست ميكرولترات من ثلاث أضراس خلات الصوديوم مع خلط. إضافة 40 ميكرولترات من الخرز تنقية المغناطيسي، و 60 ميكرولترات من ايزوبروبانول إلى العينة مع خلط شامل.واحتضان التعليق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، ضع العينة على رف مغناطيسي، حتى يصبح الحل واضحًا. إزالة عظمى واضحة، وإضافة 180 ميكرولترات من الإيثانول الطازجة 80٪ أعد إلى الخرز.بعد 30 ثانية، وإزالة الإيثانول وتدور لفترة وجيزة الأنبوب. إزالة أي السائل المتبقية التي قد جمعت في الجزء السفلي من الأنبوب، والسماح للخرز لتجف لمدة دقيقتين قبل إعادة تعليق العينة في 22 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس. بعد دقيقتين مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة.المقبل، مزيج 20 ميكرولترات من عظمى واضحة مع ستة ميكرولترات من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس في أنبوب جديد، وإضافة 40 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي و 60 ميكرولترات من 100٪ isopropanol. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، مغنطة العينة حتى الحل يبدو واضحا، قبل إزالة نابيرانت. علاج العينة مع 180 ميكرولترات من الطازجة أعد 80٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية قبل إزالة الايثانول الغزل أسفل العينة، وإزالة أي السائل المتبقية التي تراكمت في الجزء السفلي من الأنبوب.بعد السماح للخرز بالجفاف لمدة دقيقتين ، قم بإعادة تعليقها في 10 ميكرولترات من الماء الخالي من النوى ، لمدة دقيقتين ، قبل مغنطة العينة حتى يصبح الحل واضحًا. ثم، نقل تسعة ميكرولترات من سوبرناتنت إلى أنبوب جديد وإضافة ميكرولتر واحد من T4 RNA ligase العازلة، و micrcoliter واحد من الماء إلى العينة. لتنقية هلام، تشغيل خمسة وعشرة، وعشرين ميكرولترات من المنتج PCR على هلام 6٪ TBE الأصلي لمدة ساعة واحدة تقريبا.احتضان هلام الانتهاء مع الحمض النووي وصمة عار هلام في الماء لمدة عشر إلى خمس عشرة دقيقة، وعرض الجل على transilluminator للسماح استخراج 150 قاعدة زوج مكتبة الفرقة. كما أنه من الصعب عزل 150 قاعدة الزوج الفرقة التي تمثلهم، وهذه هي مكتبتنا، نظرا لوجود المنتجات الجانبية المهاجرة عن كثب سوف تحتاج إلى قطع هلام بعناية فائقة. ثم عزل الجيش الملكي النيبالي كما أظهرت للتو.لتعديل ملف تسلسل الأولية، تحميل ملفات تسلسل fastq التي تم إنشاؤها أثناء تشغيل التسلسل، و preform demultiplexing مع bcl2fastq2 حسب الضرورة. إزالة تسلسل محول باستخدام cutodapt، واستخدام الأمر كما هو موضح. استخدام seqtk كما هو مبين لإزالة النيوكليوتيدات الطرفية عشوائية في تسلسل يقرأ.ثم استخدم الأمر awk كما هو مبين، لتجاهل تسلسل أقصر من 10 نيوكليوتيدات. لتعيين التسلسلات المشذبة، افتح miRBase وقم بتنزيل ملف fa ناضج. استخدام الأمر كما هو مبين لاستبدال بقايا U مع بقايا T، إلى إنتاج قائمة كاملة من جميع RNAs الصغرى في قاعدة البيانات، التي تنشأ من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية.حدد تسلسل الحمض النووي الريبي الجزئي للكائن الحي من الفائدة، مع الأمر كما هو مبين، وتعيين يقرأ إلى الملف باستخدام bowtie2، مما يسمح عدم التطابق. استخدام أداة لمحاذاة تسلسل يقرأ إلى قاعدة البيانات، مما يتطلب أن يقرأ الخرائط تماما إلى الجيش الملكي النيبالي الجزئي لقاعدة البيانات، مع الخروج من أي عدم تطابق على النحو المشار إليه. ثم استخدم الأمر لتجاهل القراءة التي لم محاذاتها.بعد تحميل كميات متزايدة من مكتبة PCR تضخيم على هلام كما هو موضح، يمكن استخراج المنتجات المقابلة للحجم المتوقع. بعد elution، يمكن فحص المكتبة المنقاة على رقاقة جل الشعرية الكهربائية. بالإضافة إلى المنتج المتوقع 150 أساس زوج، وزيادة نسبة من 130 أنواع زوج قاعدة المقابلة لمهايئات، وعادة ما لوحظ كما يتم تحميل كمية متزايدة من المنتج PCR.ويتم الحصول على نتائج مماثلة عندما يتم إعداد المكتبات من مزيج من الرنا الصغير الاصطناعي باستخدام الكواشف من مجموعات أو لوازم أخرى. للمقارنة، تظهر النتائج المنشورة سابقا لنفس مزيج RNA الصغيرة. هنا، يتم عرض مقارنة لأداء بروتوكول TS5 مع بروتوكول TS القياسية للكشف عن الإنسان غير المعدلة واثنين من رئيس O-ميثال RNAs مصنعي معدلة.كما تم اختبار الكشف عن اثنين من الـ O-methal المعدلة piRNAs في العينات البشرية. كما لوحظ TS5 preformed أفضل بكثير من TS للكشف عن اثنين من رئيس O- ميثال RNAs، ولكن ليس لRNAs غير معدلة. تحضير مكتبات النسخ المتماثل لكل عينة في تواريخ مختلفة.عادة ما يكون هناك اختلاف بسيط بين النسخ المتماثلة التي تتم في وقت واحد، أو يمكن أن يكون هناك تباين كبير بين المكتبات التي تم إعدادها في تواريخ مختلفة.

improving-small-rna-seq-less-bias-better-detection-2-o-methyl

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

والهدف من هذا المنشور هو تصور ومناقشة الخطوات المنطوق لتعزيز بروتوكول الشمالية صمة عار على الحمض النووي الريبي المستخرج من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة والخلايا والأنسجة. هذا البروتوكول هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن كفاءة الأنواع RNA الصغيرة.

تعزيز الشمالية كشف طخة الأنواع RNA الصغيرة في الدروسوفيلاميلانوجاستر

MicroRNAs (miRNAs) هي فئة محفوظة على نطاق واسع من الجزيئات التنظيمية. نصف هنا طريقة استنساخ miRNA التي تعتمد على خطوتين قويتين للربط متبوعة بتسلسل عالي الإنتاجية. تسمح طريقتنا بالقياس الكمي الدقيق على مستوى الجينوم ل miRNAs.

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

نصف طريقة مستهدفة قائمة على تسلسل الحمض النووي الريبي تتضمن إعداد مكتبات (كدنا) المفهرسة ، والتهجين والالتقاط باستخدام مجسات مخصصة وتحليل البيانات لاستجواب النصوص المختارة للتعبير الجيني والطفرات واندماج الجينات. يسمح RNAseq المستهدف بتقييم سريع وفعال من حيث التكلفة للنصوص المحددة على جهاز التسلسل المكتبي.

استهدفت RNA تسلسل الفحص لتحديد خصائص التعبير الجيني والجينوم التعديلات

الجيل التالي التسلسل (خ ع) هو أداة قوية لتوصيف الجينوم محدود بنسبة الخطأ عالية من النظام الأساسي (~0.5–2.0%). يصف لنا أساليب عملنا لتصحيح خطأ في تسلسل التي تسمح لنا بتفادي نسبة الخطأ خ ع والكشف عن الطفرات في اليل البديل الكسور نادرة ك 0.0001.

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

يوفر هذا البروتوكول الباحثين مع أداة جديدة لرصد الإخلاص للنسخ في الكائنات نموذج متعددة.

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

هنا نقدم بروتوكول لشق DNAzyme تعتمد على RNA. وهذا يتيح التحليل السريع والمعتمد على الموقع لRNA 2'-O-methylation. ويمكن استخدام هذا النهج للتقييم الأولي أو الرئيسي لنشاط النورا.

تحليل تعتمد على DNAzyme من rRNA 2'-O-Methylation

هنا، نقوم بوصف استراتيجية خطوة بخطوة لعزل RNAs الصغيرة، وإثراء microRNAs، وإعداد عينات لتسلسل الإنتاجية العالية. ثم نقوم بوصف كيفية معالجة تسلسل القراءة ومحاذاتها إلى microRNAs، وذلك باستخدام أدوات مفتوحة المصدر.

خط أنابيب كامل لعزل وتسلسل MicroRNAs، وتحليلها باستخدام أدوات المصادر المفتوحة

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لطريقة التسلسل المستندة إلى LC-MS والتي يمكن استخدامها كطريقة مباشرة لتسلسل الحمض النووي الريبي القصير (&lt;35 nt لكل تشغيل) بدون وسيط (كدنا) ، وكطريقة عامة لتسلسل تعديلات النيوكليوتيدات المختلفة في دراسة واحدة بدقة قاعدة واحدة.

2D-HELS MS SEQ: طريقة عامة قائمة على LC-MS للتسلسل المباشر والجديد لمخاليط الحمض النووي الريبي مع تعديلات مختلفة على النيوكليوتيدات

لا يزال الكشف السريع والقياس الكمي الموثوق به لأحداث تحرير الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم أمرا صعبا ويعتمدان حاليا على طرق تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة (μTGGE) كطريقة بسيطة وسريعة ومحمولة للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي.

نهج غير تسلسلي للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي

تسلسل الحمض النووي الريبي الكمي المطلق (AQRNA-seq) هو تقنية تم تطويرها لتحديد المناظر الطبيعية لجميع الحمض النووي الريبي الصغير في الخلائط البيولوجية. هنا ، يتم عرض كل من خطوات إعداد المكتبة ومعالجة البيانات الخاصة ب AQRNA-seq ، وتحديد التغيرات في تجمع الحمض النووي الريبي الناقل (tRNA) في المتفطرة البوفية BCG أثناء السكون الناجم عن الجوع.

AQRNA-seq لقياس كمية الحمض النووي الريبي الصغير

يسمح هذا البروتوكول بمراقبة الجودة الأولية لتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي لعلماء الأحياء في المختبرات الرطبة ذوي الخبرة المحدودة في المعلوماتية الحيوية.

Rup (خط أنابيب تقييم قابلية الاستخدام RNA-seq) - مراقبة الجودة لتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة في حقيقيات النوى

اكتشف بروتوكول تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي الصغير ذو التحيز المنخفض والحساسية العالية لكشف RNAs 2'-O-Methyl. يوفر هذا الأسلوب مرونة استخدام المواد المحلية أو التجارية.

تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl

استكشف المزيد من الفيديوهات