تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl

RNA صغيرة تنظيم العديد من العمليات البيولوجية. ولذلك من المهم تطوير أساليب حساسة وغير متحيزة للكشف عنها. ويوفر بروتوكولنا خطوات إلى الأمام نحو تحقيق هذا الهدف.

بروتوكولنا يعاني من قضايا التحيز أقل، من الطرق التقليدية الصغيرة RNA مكتبة الاعتماد، والأهم من ذلك أنه يسمح للكشف أكثر حساسية من شقين أو meso-RNAs. مثل النباتات الصغيرة RNAs. بعد استخراج RNA مجموع وفقا للبروتوكولات القياسية.

تشغيل ما قبل 15٪ من هلام اليوريا TBE لمدة خمسة عشر دقيقة في 200 فولت. وخلط خمسة إلى عشرين ميكروغرام من مجموع RNA، في حجم ميكرولتر خمسة إلى خمسة عشر، مع حجم متساو من صبغة تحميل الفورماميد في أنبوب ميكرولتر 200. بعد خمس دقائق في 65 درجة مئوية، في دراجة الحرارة مع غطاء ساخن، ووضع الأنابيب فورا على الجليد وتحميل هذا الأخير وعينة على هلام مع حارة واحدة على الأقل بينهما.

ثم تشغيل الجل في 200 فولت حتى بروموفينول قد هاجرت حوالي ثلثي طول الجل. لتحميل الجيش الملكي النيبالي، ثقب أول الجزء السفلي من نواة حرة 0.5 ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الجزئي، مع إبرة قياس 21، ووضع أنبوب ثقب في نواة جولة حرة أسفل اثنين ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الصغير. بعد ذلك ، احتضان الجل في درجة حرارة الغرفة مع وصمة هلام حمض نووي في الماء لمدة عشر إلى خمس عشرة دقيقة ، قبل عرض الجل على transilluminator.

قطع عينة RNA بين 17 و 29 نطاق سلم النيوكليوتيدات، ونقل قطعة هلام في أنبوب ثقب. تدور أسفل هلام في جهاز طرد مركزي صغير في أقصى سرعة لمدة دقيقتين، وإزالة أنبوب 0.5 ملليلتر التي ينبغي أن تكون فارغة الآن. إضافة 300 ميكرولترات من النوى الحرة 0.3 ظروس كلوريد الصوديوم إلى هلام سحقت، ووضع الأنبوب على دوار لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية نهاية الحضانة، نقل قطع هلام سحقت تعليق إلى عمود تدور، والطرد المركزي لمدة دقيقتين في السرعة القصوى في أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. ل غير اللوين ثلاثة إزالة محول رئيس، مزيج دقيق عشرة microliters نواة المياه الحرة مع عينة الحمض النووي الريبي المستخرجة، وإضافة ست ميكرولترات من ثلاث أضراس خلات الصوديوم مع خلط. إضافة 40 ميكرولترات من الخرز تنقية المغناطيسي، و 60 ميكرولترات من ايزوبروبانول إلى العينة مع خلط شامل.

واحتضان التعليق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، ضع العينة على رف مغناطيسي، حتى يصبح الحل واضحًا. إزالة عظمى واضحة، وإضافة 180 ميكرولترات من الإيثانول الطازجة 80٪ أعد إلى الخرز.

بعد 30 ثانية، وإزالة الإيثانول وتدور لفترة وجيزة الأنبوب. إزالة أي السائل المتبقية التي قد جمعت في الجزء السفلي من الأنبوب، والسماح للخرز لتجف لمدة دقيقتين قبل إعادة تعليق العينة في 22 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس. بعد دقيقتين مغنطة العينة حتى يظهر الحل واضحة.

المقبل، مزيج 20 ميكرولترات من عظمى واضحة مع ستة ميكرولترات من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس في أنبوب جديد، وإضافة 40 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي و 60 ميكرولترات من 100٪ isopropanol. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، مغنطة العينة حتى الحل يبدو واضحا، قبل إزالة نابيرانت. علاج العينة مع 180 ميكرولترات من الطازجة أعد 80٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية قبل إزالة الايثانول الغزل أسفل العينة، وإزالة أي السائل المتبقية التي تراكمت في الجزء السفلي من الأنبوب.

بعد السماح للخرز بالجفاف لمدة دقيقتين ، قم بإعادة تعليقها في 10 ميكرولترات من الماء الخالي من النوى ، لمدة دقيقتين ، قبل مغنطة العينة حتى يصبح الحل واضحًا. ثم، نقل تسعة ميكرولترات من سوبرناتنت إلى أنبوب جديد وإضافة ميكرولتر واحد من T4 RNA ligase العازلة، و micrcoliter واحد من الماء إلى العينة. لتنقية هلام، تشغيل خمسة وعشرة، وعشرين ميكرولترات من المنتج PCR على هلام 6٪ TBE الأصلي لمدة ساعة واحدة تقريبا.

احتضان هلام الانتهاء مع الحمض النووي وصمة عار هلام في الماء لمدة عشر إلى خمس عشرة دقيقة، وعرض الجل على transilluminator للسماح استخراج 150 قاعدة زوج مكتبة الفرقة. كما أنه من الصعب عزل 150 قاعدة الزوج الفرقة التي تمثلهم، وهذه هي مكتبتنا، نظرا لوجود المنتجات الجانبية المهاجرة عن كثب سوف تحتاج إلى قطع هلام بعناية فائقة. ثم عزل الجيش الملكي النيبالي كما أظهرت للتو.

لتعديل ملف تسلسل الأولية، تحميل ملفات تسلسل fastq التي تم إنشاؤها أثناء تشغيل التسلسل، و preform demultiplexing مع bcl2fastq2 حسب الضرورة. إزالة تسلسل محول باستخدام cutodapt، واستخدام الأمر كما هو موضح. استخدام seqtk كما هو مبين لإزالة النيوكليوتيدات الطرفية عشوائية في تسلسل يقرأ.

ثم استخدم الأمر awk كما هو مبين، لتجاهل تسلسل أقصر من 10 نيوكليوتيدات. لتعيين التسلسلات المشذبة، افتح miRBase وقم بتنزيل ملف fa ناضج. استخدام الأمر كما هو مبين لاستبدال بقايا U مع بقايا T، إلى إنتاج قائمة كاملة من جميع RNAs الصغرى في قاعدة البيانات، التي تنشأ من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية.

حدد تسلسل الحمض النووي الريبي الجزئي للكائن الحي من الفائدة، مع الأمر كما هو مبين، وتعيين يقرأ إلى الملف باستخدام bowtie2، مما يسمح عدم التطابق. استخدام أداة لمحاذاة تسلسل يقرأ إلى قاعدة البيانات، مما يتطلب أن يقرأ الخرائط تماما إلى الجيش الملكي النيبالي الجزئي لقاعدة البيانات، مع الخروج من أي عدم تطابق على النحو المشار إليه. ثم استخدم الأمر لتجاهل القراءة التي لم محاذاتها.

بعد تحميل كميات متزايدة من مكتبة PCR تضخيم على هلام كما هو موضح، يمكن استخراج المنتجات المقابلة للحجم المتوقع. بعد elution، يمكن فحص المكتبة المنقاة على رقاقة جل الشعرية الكهربائية. بالإضافة إلى المنتج المتوقع 150 أساس زوج، وزيادة نسبة من 130 أنواع زوج قاعدة المقابلة لمهايئات، وعادة ما لوحظ كما يتم تحميل كمية متزايدة من المنتج PCR.

ويتم الحصول على نتائج مماثلة عندما يتم إعداد المكتبات من مزيج من الرنا الصغير الاصطناعي باستخدام الكواشف من مجموعات أو لوازم أخرى. للمقارنة، تظهر النتائج المنشورة سابقا لنفس مزيج RNA الصغيرة. هنا، يتم عرض مقارنة لأداء بروتوكول TS5 مع بروتوكول TS القياسية للكشف عن الإنسان غير المعدلة واثنين من رئيس O-ميثال RNAs مصنعي معدلة.

كما تم اختبار الكشف عن اثنين من الـ O-methal المعدلة piRNAs في العينات البشرية. كما لوحظ TS5 preformed أفضل بكثير من TS للكشف عن اثنين من رئيس O- ميثال RNAs، ولكن ليس لRNAs غير معدلة. تحضير مكتبات النسخ المتماثل لكل عينة في تواريخ مختلفة.

عادة ما يكون هناك اختلاف بسيط بين النسخ المتماثلة التي تتم في وقت واحد، أو يمكن أن يكون هناك تباين كبير بين المكتبات التي تم إعدادها في تواريخ مختلفة.