Name: تنقيه الS100A12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: تعلم تنقية بروتين S100A12 البشري والأوليغوميرات الناتجة عن الأيونات لدراسة الاستجابات المناعية. تُستخدم هذه التقنية لتحفيز الخلايا الوحيدة وتطوير تدخلات علاجية جديدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وكانت هذه الدراسة مدعومة بمنح من برنامج البحوث الطبية المبتكرة داخل كليه الطب بجامعه مونستر (KE121201 إلى سي كي) ومؤسسه البحوث المانيه (DFG ، Fo354/3-1 إلى D.F).

<ol><li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li>
<li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation%3A+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li>
<li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron%28ii%29+binding+to+human+calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+human+%28S100A8%2FS100A9%292+heterotetramer%2C+calprotectin%2C+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Ca2%2B+and+Zn2%2B+are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11(2009).</li>
<li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha%2C+S100a+%28alpha+beta%29%2C+and+S100b+%28beta+beta%29+protein%3A+Zn2%2B+regulates+Ca2%2B+binding+on+S100b+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li>
<li>Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C%2C+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li>
<li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis%3A+a+central+cell+surface+receptor+for+S100%2Fcalgranulin+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li>
<li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li>
<li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells%3A+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li>
<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Strategies+for+Protein+Purification.+Handbook%22">Strategies for Protein Purification. Handbook</a>. , Freiburg, Germany. (2010).</li>
<li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+Purification%2C+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li>
<li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li>
<li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
<li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li>
<li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+Ca2%2B-bound+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li>
<li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+-+Sartorius+Stedim+Biotech%22">Application Note - Sartorius Stedim Biotech</a>. , (2010).</li>
<li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li>
<li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha%2FNF-kappa+B+and+ERK1%2F2+pathways+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li>
<li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف خاليه من العلامات البكتيرية التعبير عن S100A12 الإنسان وتنقيتها ، فضلا عن الانفصال في مختلف الأيونات الناجمة عن الايونيه لتحفيز الخلايا المناعية. بالمقارنة مع المؤلفات المنشورة علي S100A12 تنقيه البروتين8،23،24، واستخدام عاليه cacl2 (25 ملم) في اللوني التفاعل مسعور هو لمعرفتنا فريدة من نوعها. العديد من البروتوكولات تطبيق تركيزات من 1 إلى 5 ملم لا تنتج البروتين النقي ، ومع ذلك لاحظنا عده مر...

S100A12 هو بروتين ملزم الكالسيوم الذي يتم إنتاجه في الغالب من قبل المحببات البشرية. يتم الإفراط في البروتين خلال (الجهازية) التهاب ومستويات المصل ، وخاصه في (السيارات) الامراض التهابيه مثل التهاب المفاصل الجهازية الاحداث مجهول الشكل (sJIA) ، حمي البحر الأبيض المتوسط العائلية (FMF) أو مرض كاواساكي (KD) يمكن ان تبلغ عن نشاط المرض والاستجابة للعلاج. اعتمادا علي مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs) مثل المستقبلات مثل الحصيلة (TLRs) ، يمكن تنشيط الجهاز المناعي الفطري من الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) مثل الليبوكوليساشاريدس (LPS) أو تلف الأنماط الجزيئية المرتبطة (DAMPs; ويطلق عليه أيضا اسم "الاردقائق". DAMPs هي جزيئات الذاتية مثل البروتينات الخلوية ، والدهون أو الأحماض النووية1. ووصفت بشكل جيد وظائف رطبه لأعضاء عائله البروتين كالغرولين ، S100A8/A9 و S100A122، والتي يتم أيضا الإبلاغ عنها للعمل كمعدن ثنائي التكافؤ الأيونات المضادة للميكروبات الببتيدات3،4، 5,6. [دبندينغ ون] ال يتوفر أيون قوه S100A12 علبه, مثل أخرى أعضاء من ال S100 أسره, يرتب داخل [هوميمرمررس] مختلفه وحتى مؤخرا التاثير من [S100A12-اوليغمرايشن] علي [بر]-تفاعل, بشكل خاص TLR4, كان مجهوله.
يتكون البروتين الأحادي الشكل (92 الأحماض الامينيه ، 10.2 كده) من اثنين من الهياكل الحلزونية اللولبية المتصلة بواسطة رابط مرن. و C-الطرفية ef-اليد يحتوي علي الكلاسيكية Ca2 +-ربط عزر في حين ان N-الطرفية ef-اليد يسلك هيكل حلقه موسعه البروتين الخاصة S100 (' الزائفة-ef-اليد ') ويكشف انخفاض Ca2 +-تقارب. Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 يمكن ان تحفز علي تغيير المطابقة الرئيسية في البروتينات ' C-المحطة ، مما يؤدي إلى التعرض لرقعه مسعورة علي كل مونومر ويشكل واجهه ديميريشن. وهكذا ، في ظل الظروف الفسيولوجية ، أصغر هيكل رباعي شكلتها S100A12 هو ديمر غير التكافؤ (ما يقرب من 21 كده) فيها مونومرات الفردية في اتجاه مضاد للمتوازي. عندما رتبت كما dimer, وذكرت S100A12 لتنحيه الزنك2 + فضلا عن غيرها من أيونات المعادن ثنائي التكافؤ, علي سبيل المثال, Cu2 + مع تقارب عاليه7. وتنسق هذه الأيونات في واجهه S100A12 ديمر بواسطة الأحماض الامينيه H15 وD25 الوحدة الفرعية واحده وH85 فضلا عن H89 الفرعية الأخرى8,9,10المضادة لمتوازي الأضلاع. في حين ان الدراسات السابقة تقترح ان الزنك2 +-تحميل S100A12 قد تحفز منظمه البروتين إلى الإنسان-الترام (44 كده) ويؤدي إلى زيادة Ca2 +-تقارب11,12, المعايرة الاخيره المعادن دراسات6 تشير Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 لزيادة تقارب البروتين إلى الزنك2 +. مره واحده S100A12 EF-الأيدي التي احتلت بالبالكامل من قبل Ca2 +، ويعتقد ca2 + اضافيه للربط بين الدمامل ، مما اثار تشكيل hexamer (حوالي 63 كده). ومن الواضح ان البنية المعمارية للهيكل السداسي الأضلاع مختلفه عن الهيكل الرباعي. ومن المقترح ان يتم تعطيل واجهه رباعيه لتؤدي إلى واجات dimer-dimer الجديدة التي تفيد تشكيل hexamer10. يتم التعبير عن S100A12 بشكل حصري تقريبا من قبل المحببات البشرية حيث تشكل حوالي 5 ٪ من جميع البروتين السيتووليك13. في وظيفته رطبه S100A12 وصفت تاريخيا بأنه ناهض من متعددة ligand مستقبلات للمنتجات النهائية glycation المتقدمة (الغضب) ، ثم وصفت حديثا خارج الخلية المعروفة الغضب البروتين ملزمه (EN-الغضب)14. وان كنا قد أبلغت في وقت سابق S100A12 البيوكيميائية لكل من الغضب و TLR415، ونحن أظهرت مؤخرا الخلايا الاحاديه الإنسان للرد علي التحفيز S100A12 بطريقه تعتمد علي TLR416. وهذا يتطلب ترتيب S100A12 في المرجع المصدق2 +/Zn2 +-المستحثة سداسي الأضلاع هيكل كوارتيراري16.
هنا نحن وصف اجراء تنقيه لS100A12 البشرية المؤتلف والتي يسببها الأيونات لتحفيز الخلايا المناعية16,17. ويستند هذا علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تتضمن في البداية عمود انيون-تبادل لعزل وتركيز البروتين وأزاله التلوث السائبة (علي سبيل المثال ، اندوتوكسين/ليبووليساشاريدس)18. راتنجات الفصل اللوني للتبادل الأيوني بروتينات منفصلة علي أساس مختلف صافي الرسوم السطحية. للبروتينات الحمضية مثل S100A12 (نقطه ايزوالكتريك من 5.81) ، ونظام العازلة مع درجه الحموضة من 8.5 وقويه انيون-تبادل الراتنج يؤدي إلى فصل جيد. تم التملص من البروتينات المنضمة مع التدرج العازلة عاليه الملح. مع زيادة الأيونات السلبية قوه الايونيه في العازلة التهرب تتنافس مع البروتينات للرسوم علي سطح الراتنج. البروتينات بشكل فردي الوت اعتمادا علي صافي التهمه ونتيجة لذلك ، والمخازن المؤقتة الموصوفة هنا تسمح لعزل وتركيز البروتين S100A12 الإفراط في التعبير. بسبب الجماعات المشحونة سلبا في الليبووليساشاريدس ، ترتبط هذه الجزيئات أيضا إلى راتنجات التبادل انيون. ومع ذلك ، فان ارتفاع الرسوم الصافية يؤدي إلى التملص في وقت لاحق في التدرج عاليه الملح المطبق. وقد تم إدخال الخطوة الثانية من اجراء تنقيه لتلميع الأغراض. وهذا يجعل استخدام قدره ربط الكالسيوم من S100A12 ويزيل الشوائب المتبقية علي عمود التفاعل مسعور. الكالسيوم ملزمه من S100A12 يؤدي إلى تغيير المطابقة والتعرض للبقع مسعور علي سطح البروتين. علي هذا الشرط ، يتفاعل S100A12 مع سطح مسعور من الراتنج. علي الكالسيوم-chelating من قبل أدتا ، يتم عكس هذا التفاعل. في وجود الأيونات ، وخاصه الكالسيوم والزنك ، S100A12 يرتب في الأقليات homomeric. لدراسة هيكل العلاقات وظيفة من القلة المختلفة ، ونحن استقرت ديميريك ، رباعيه الS100A12 والمؤتلف هيكاميرك مع الرابط الكيميائية وفصل المجمعات علي عمود اللوني الاستبعاد الحجم. وأخيرا ، لتحليل الأداء الوظيفي والنشاط البيولوجي للبروتين المنقي والقلة المستحثة بالأيونات ، يمكن مقارنه الإصدار الخلوي من S100A12 و LPS الذي يحفز البويضة الاحاديه.
وقد وصفت طرق مختلفه لتنقيه S100A12 حتى الآن. وعلي سبيل المثال ، نشر جاكسون وآخرون19بروتوكولا بالتنقية عن طريق عمود التبادل انيون والفصل اللوني اللاحق لحجم الاستبعاد. تلميع تنقيه علي عمود الحجم الاستبعاد يؤدي إلى نتائج جيده ، ولكن-بسبب علي سبيل المثال احجام التحميل محدوده-اقل مرونة في قابليه التحجيم. نهج مختلف ، نشرتها قبله وآخرون20، يصف تنقيه البروتين الموسومة عن طريق Ni2 + عمود التقارب كخطوه تنقيه الاولي ، تليها الانقسام الانزيمي لأزاله العلامة والمزيد من خطوات تنقيه. علي النقيض من الدراسات aforecited19،20، يتم تحديد البروتين المنتجة كما هو موضح في هذا البروتوكول للتجارب علي الخلايا المناعية. ولذلك ، فان بقايا التسمم المعوي من الثقافة البكتيرية هو تحد. علي الرغم من انه قد تم وصف النهج المختلفة لأزاله الذيفان المعوي حتى الآن ، لا توجد طريقه موحده تعمل بشكل جيد علي قدم المساواة لأي محلول بروتين معين21،22.
وباختصار ، فان بروتوكولنا يجمع بين مزايا التعبير الخالي من العلامات في نظام بكتيري مع أزاله اندوتوكسين فعاله والغلة العالية من البروتين النقي.

<table><tbody><tr><td>pET11b ناقلات</td><td>Novagen</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>BL21 (DE3) المختص الإشريكية القولونية </td> <td>نيو إنجلاند بيولابس</td><td>C2527</td> <td>< قوي>&nbsp ؛ </td></tr><tr><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; < / قوي></td></tr><tr><td>100x الأحماض الأمينية غير الأساسية Merck</td><td></td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25٪ HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4 & ناقص ؛ 20٪ جل بروتين Mini-PROTEAN TGX</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>ملح الصوديوم أمبيسلين</td><td>كارل روث</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (مكرر (سلفوسوكسينيميديل) سوبيرات) - 50 مجم</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>كالسيوم كلوريد ثنائي هيدرات</td><td>كارل روث</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 محلول تلطيخ</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep طقم تخصيب الخلايا الأحادية البشرية</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>طقم عزل الخلايا السالبة المغناطيسية</td></tr><tr><td>EDTA ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم</td><td>كارل روث</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>الكشف عن السموم الداخلية فحص</td></tr> ماء <tr><td>فائق النقاء خال من السموم</td><td>الداخلية سيجما-ألدريتش</td><td>TMS-011-A</td><td>ماء عالي النقاء لتحضير المخازن الخالية من السموم</td></tr><tr><td>الداخلية EndoTrap red</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>راتنج إزالة السموم</td></tr><tr><td>الداخلية FBS (معطل حراريا)</td> <td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>كارل روث</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>هيبس (خصية ذيفان داخلي عالية الجودة)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alpha - مجموعة OptEia ELISA</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranosid)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية < م > O55: B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll ،</td> محلول فصل <td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td>(الطرد المركزي المتدرج الكثافة)</td></tr> <tr><td>البنسلين / الستربتومايسين (10.000 وحدة / مل) ميرك</td><td></td> <td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>فينيل سيفاروز عالي الأداء</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>راتنج ل كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء</td></tr><tr><td>Polymyxin B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>أقراص مثبطات البروتياز</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>راتنج لكروماتوغرافيا تبادل الأنيون</td></tr><tr><td>RoboSep العازلة</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>المخزن المؤقت لفصل الخلايا (القسم 5.1.4)</td></tr> <tr><td>RPMI 1640 متوسط</td><td>ميرك</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)</td> <td>كارل روث</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>كارل روث</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>تريس بيس</td><td>كارل روث</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الزنك</td><td>كارل روث</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><قوي > مختبر < قوي></td><td></td> <td>قوي</td><td></td></tr><tr><td>0,45 & الميكرو; مرشح المحقنة</td><td>m Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 مل أنابيب مستديرة</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 لتر قارورة Erlenmyer</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 ألواح تعليق بئر</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 لتر دورق قياس</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة</td><td>Eppendorf</td><td>3،01،22،178</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي MWCO 3 كيلو دالتون</td><td>ميرك</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي MWCO 50 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>طبق ثقافة (100 مم)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr> إغلاق <tr><td>أنابيب غسيل الكلى</td><td>طيف</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>مغناطيس EasySep "The Big Easy"</td> <td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب تجميع الكسور 5 مل</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>فيلم Lumox ، 25 & micro ؛ م ، 305 مم × 40 م</td><td>Sarstedt</td><td>94،60،77،316</td><td>فيلم لألواح ثقافة الخلايا</td></tr><tr><td>الأحادية Spectra / Por غشاء غسيل الكلى (3.5 كيلو دالتون) وحدة</td> <td>تصفية 132724</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الطيف</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><قوي > المعدات < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>37 درجة ؛ حاضنة C (مع الاهتزاز) نيو</td> <td>برونزويك Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr> <tr><td>& Auml ؛ جهاز تنقية KTA UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC System</td></tr><tr><td>Fraction</td><td>Collector GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>طرد مركزي (مع الدوار A-4-81)</td> <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>دوار بزاوية ثابتة</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>قارئ مضان</td><td>Tecan</td><td>لانهائي M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الأس الهيدروجيني</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

تنقيه الs100a12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لتنقيه الإنسان الكالسيوم ملزمه البروتين S100A12 ولها الأيونات الناجمة عن الايونيه من الثقافة القولونية لتحفيز الخلايا المناعية. ويستند هذا البروتوكول علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تشمل البروتين قبل تنقيه علي عمود اللوني التبادل انيون وخطوه تلميع اللاحقة علي عمود التفاعل مسعور. وتنتج هذه الاستراتيجية S100A12 بروتين عالي النقاء والغلة بتكاليف يمكن التحكم فيها. لاختبارات وظيفية علي الخلايا المناعية بقايا في نهاية المطاف التلوث اندوتوكسين يتطلب الرصد الدقيق والمزيد من الخطوات التنظيف للحصول علي البروتين الخالي من اندوتوكسين. ويمكن استبعاد غالبيه تلوث السمية المعوية من خلال الفصل اللوني لتبادل انيون. لاستنفاد تلوث المتبقية ، يصف هذا البروتوكول خطوه أزاله مع مرشحات الطرد المركزي. اعتمادا علي القوه الأيون المتاحة S100A12 يمكن ان يرتب في homomultimers مختلفه. وللتحقيق في العلاقة بين الهيكل والوظيفة ، يصف هذا البروتوكول أيضا المعالجة الايونيه للبروتين S100A12 التي تليها الوصلات الكيميائية لتحقيق الاستقرار S100A12 قله المواليد وانفصالها اللاحق بالحجم-الاستبعاد اللوني. وأخيرا ، فاننا نقوم بوصف الفحص القائم علي الخلايا الذي يؤكد النشاط البيولوجي للبروتين المنقي ويؤكد التحضير الخالي من LPS.

وبعد التنقية المسبقة علي عمود AIEX (الشكل 1ا-ج) وما تلاها من الائتلاف الذي يعتمد علي الكالسيوم (الشكل 2ا ، ب) ، تم الحصول علي بروتين نقي للغاية (الشكل 2c). الاضافه إلى ذلك ، كشفت قياسات السمية المعوية أزاله LPS ناجحه. تم قياس المحتوي LPS بعد AIEX في التخفيف 1:10 فوق حد الكشف عن الفحص ، اي فوق 500 الاتحاد الأوروبي/mL. بعد الترشيح الأول من خلال وحده تصفيه 50 ده ، تم تخفيض محتوي LPS إلى 1 الاتحاد الأور...

يصف هذا البروتوكول طريقه تنقيه لبروتين الكالسيوم الخالي من العلامات المؤتلف S100A12 والقلة المستحثة بالأيونات لاختبارات تحفيز البويضات البشرية.

تنقيه الS100A12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

يصف هذا البروتوكول إجراء تنقية كامل لبروتين ربط الكالسيوم البشري ، S100A12 ، وعلى وجه الخصوص ، لأنه مختلف القلايغومات الناجمة عن الأيونات للآثار البحثية في المصب. مع هذه التقنية، ونحن قادرون على الحفاظ على غلة عالية من البروتين النقي جدا وineotoxin خالية. الكيميائية عبر ربط وفصل على حجم استبعاد العمود الكروماتوغرافيا هو وسيلة مقنعة لتوليد البروتينات المثلية oligomeric لمزيد من المقايسات الوظيفية.يسمح لنا أسلوبنا بالجوانب الميكانيكية لـ S100A12 كـ رابطة مستقبلات التعرف على النمط والمعلومات الفنية لتطوير تدخلات مستهدفة جديدة وتحسين الفحوصات التشخيصية. بالإضافة إلى مشاهدة هذا الفيديو، نوصي بقراءة دقيقة للبروتوكول، كما وصفنا إجراءً معقدًا متعدد الخطوات. للبدء، قطع أنابيب غسيل الكلى إلى طول مناسب، حوالي 30 سم، مع مساحة إضافية للهواء.نقع الغشاء في المياه ديونسيد لمدة 15 إلى 30 دقيقة لإزالة الجلسرين. للحد من اللزوجة من محلول البروتين تطهيرها، وتمييع الحل مع 25 ملليلتر من AIEX العازلة A.إرفاق الإغلاق الأول على الأنابيب. قم بتحميل العينة في الغشاء وإرفاق الإغلاق الثاني بسنتيمتر واحد على الأقل من الطرف العلوي من الأنبوب.في غرفة مبردة عند أربع درجات مئوية، ضع الحاوية مع عازل AIEX A على لوحة تحريك، وأضف شريط التحريك، والغشاء المليء بمحلول البروتين. ضبط السرعة لتدوير العينة بحيث لا يكون هناك أي تدخل مع شريط اثارة الدورية. Dialyze لمدة 12 إلى 24 ساعة في أربع درجات مئوية ثم استبدال المخزن المؤقت dialyzed مع عازلة قبل التبريد مجانا و تستمر لمدة أربع ساعات إضافية على الأقل.نقل محلول البروتين dialyzed من الأنابيب إلى أنبوب 50 ملليلتر من خلال وحدة مرشح 0.45 ميكرون. بدء تشغيل FPLC مع الصيانة العامة. ربط مخازن العمود AIEX A و AIEX B إلى صمامات المخزن المؤقت وراتنج تبادل anion يحتوي على عمود إلى منافذ العمود من FPLC.ضبط المعلمات الكروماتوغرافية العامة وفقا لذلك. بدء تشغيل برنامج AIEX في برنامج FPLC واختيار وحدة التخزين توازن للمخزن A.لاحقاً، تحميل العينة على العمود وeute البروتينات مع تدرج خطي من 0٪ إلى 100٪ عالى العازلة الملح. جمع اثنين من الكسور ملليلتر أثناء elution.تحليل الكسور مائل بعد الانتهاء من تشغيل. لهذا، تحميل 10 ميكرولترات من كل كسر على Coomassie ملطخة 15٪ SDS الصفحة وتحديد الكسور التي تحتوي على S100A12. تجمع هذه S100A12 تحتوي على كسور لغسيل الكلى في المالحة TRIS المخزن.لمواصلة تنقية البروتين، بعد غسيل الكلى البروتين، إضافة كلوريد الكالسيوم إلى العينة إلى تركيز النهائي من 25 ملليمتر، والتي سوف تسهل ربط S100A12 إلى الراتنج في الخطوة التالية. ثم، تصفية العينة من خلال مرشح مع حجم صب من 0.45 ميكرون. اكويريبرات HIC مخازن وعينات إلى أربع درجات مئوية.بعد ذلك، قم بتوصيل مخازن العمود HIC A و B والعمود بالنظام وضبط المعلمات. ابدأ الأسلوب لتكبيل العمود بأحجام أعمدة إلى عمودين من المخزن المؤقت HIC A وتحميل العينة وكتلة عينة الغسيل غير المنضمة مع إشارة الأشعة فوق البنفسجية تصل إلى مستوى خط الأساس مرة أخرى. ثم ابدأ الاستلليس مع chelator الكالسيوم التي تحتوي على EDTA العازلة.جمع مليلترين من الكسور الذروة خلال elution. بعد تحليل 10 ميكروليتر من كل كسر على Coomassie ملطخة 15٪ SDS صفحة تحديد كسور S100A12 نقية. تجمع هذه الكسور و dialyze ضد HBS.أولاً، قم بتحميل 15 ملليلتر من العينة على وحدة تصفية طردية 50 كيلودالون. أجهزة الطرد المركزي في 3200 مرة ز في 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا. نقل تدفق الترشيح من خلال إلى وعاء جديد، على الجليد.الآن، استخدام ملليلتر واحد من HBS لشطف غشاء التصفية ولتخفيف من الحل المركز في طرف التصفية. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لاسترداد أكبر قدر ممكن من البروتين في تدفق من خلال. لتصفية الحل، كرر نموذج التحميل والطرد المركزي كلما لزم الأمر.بعد ذلك، لتركيز S100A12 التي تحتوي على تدفق من خلال، وتحميله في مرشح الطرد المركزي ثلاثة كيلودالون والطرد المركزي في 3200 مرات ز، 10 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا. الآن يتم تقليل حجم إلى 1/5 حتى 1/10 من حجم التحميل الأولي. نقل الحل المركز إلى أنبوب جديد.كرر خطوة التركيز كلما لزم الأمر. بعد الربط الكيميائي، وفقا للمخطوطة، قم بإجراء تصوير اللوني استبعاد الحجم. قم بتكدير العمود في HBS، ثم قم بتحميل العينة، ثم قم بتجميع كسور الذروة من ملليلتر واحد إلى ملليلتر أثناء التشغيل.بعد تحليل هذه الكسور على صفحة SDS متدرجة من أربعة إلى 20٪، تجمع الكسور مع عصابات رئيسية من مجمع البروتين المطلوب. ثم ركز الحلول كما فعلت سابقا. لعزل monocytes من المعاطف بافي الإنسان من قبل كثافة القذف الانحدار، أولاً توازن حل الفصل لدرجة حرارة الغرفة.نقل 20 ملليلتر في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 ملليلتر، اثنين من الأنابيب لكل معطف برتقالي. تخفيف الدم من معطف بافي الإنسان مع HBSS إلى حجم إجمالي 60 ملليلتر وطبقة 30 ملليلتر من هذا الخليط بعناية على رأس وسيط الفصل. أجهزة الطرد المركزي عند 550 مرة ز لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.أطفئ مكبح جهاز الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، تقع خلايا الدم الطرفية أحادية النوى مباشرة فوق وسط الفصل. مع ماصة، ونقل هذه الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر الطازجة.املأ الأنبوب بـ HBSS إلى 50 ملليلتر وطاردة مركزية بمعدل 170 ضعف غرام لمدة 10 دقائق. التعرق وssuspend بيليه الخلية في حجم صغير من HBSS عن طريق الأنابيب. ثم، تعبئة أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر والطرد المركزي في 290 مرات ز لمدة 10 دقائق.استلهموا المُتفوّه مجدداً إعادة تعليق الخلايا في 50 ملليلتر من HBSS والطرد المركزي في 170 مرة ز لمدة 10 دقائق. اضمب اطالة و resuspend بيليه الخلية في حجم صغير من ملليلتر واحد من العازلة الفصل، عد الخلايا، وإضافة العازلة إلى تركيز من خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر.بالنسبة لعزلة أحادية الخلايا من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة، استخدم مجموعة عزل الخلايا السالبة المغناطيسية واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. استخدام عداد خلية مؤتمتة لحساب أحادية و resuspend في متوسطة أحادية التركيز من مرتين 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. لثقافة أحادية، وضع طبق ثقافة الخلية مع فيلم الغاز نفاذية المياه مناسبة للخلايا المعلقة.ضع اللوحات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تقريباً للتعقيم. نقل 15 إلى 25 ملليلتر من تعليق الخلية إلى هذه اللوحات الثقافة والسماح لهم الراحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪. بعد ما قبل تنقية على عمود AIEX والكالسيوم المعتمد على الكالسيوم اللاحق، تم الحصول على بروتين نقي للغاية.كتحكم إضافي، تم تحفيز أحاديات الإنسان مع LPS وأنتجت بروتين من النوع البري. ينتج عن التعرض للبروتين للأيونات المختلفة ترتيب أُزهِم S100A12 oligomers المختلفة. زيادة تركيزات الزنك تحفز ترتيب S100A12 في رباعيات و hexamers عند الفصل على أربعة إلى 20٪ Coomassie صفحة SDS الملون.وعندما يُطبَّق فائض من الأيونات قبل الربط المتبادل، فإن ذلك يحدث تحولاً واضحاً في توازن القلة. S100A12 كانت مرتبطة عبر في وجود إما 25 ملليمولار الكالسيوم أو 25 ملليمولار الكالسيوم والزنك ميليمولار واحد. بعد الربط المتبادل في العازلة HBS مع كلوريد الكالسيوم 25 ملليمولر وكلوريد الزنك ميليمولار واحد، تم فصل الهيكسمر ورباعيمر.تم فصل رباعية التمرس واليمدر في عازلة HBS مع كلوريد الكالسيوم 25 ملليمولر. مثال على oligomers المجمعة والمركزة بعد الانفصال على Coomassie الملون من أربعة إلى 15 ٪ صفحة SDS التدرج يظهر أكثر خافت ، tetramer ، والهيكسمر. أدى التحفيز أحادية مع سداسية S100A12 في وضوحا TNF ألفا الافراج.بعد إزالة السمية endotoxin، من المهم عدم إعادة إدخال التلوث في العينات أثناء توليد وتنقية القلة اللاحقة. يمكن تصور تحليل المراحل النهائية لأي عملية تتعلق بـ S100A12 oligomerization. وبالمثل، يمكن تحليل الأحماض الأمينية والظروف الأيونية التي تؤثر على عملية oligomerization نفسها.نحن حاليا باستخدام oligomers S100A12 فصل وفقا للبروتوكول الموصوف لتطوير يغاندات الببتيد محددة والأجسام المضادة لمنع إشارات البروتين من خلال TLF4 وتطوير وتحسين التشخيص المقايسة.

purification-human-s100a12-its-ion-induced-oligomers-for-immune-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

في عصر ما بعد الجينوم البشري، وتوافر البروتينات المؤتلف في التشكل الأصلية أمر حاسم لبحث الهيكلية والوظيفية والعلاجية والتنمية. هنا، نحن تصف تجارب واسعة النطاق نظام التعبير بروتين في الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى التي يمكن استخدامها لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات المؤتلف.

ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية كروماتوغرافيا تبادل الأنيون لتنقية S100A12 البروتين البشري المرتبط بالكالسيوم بناء على صافي الشحنة السطحية للبروتين من ثقافة الإشريكية القولونية.

تنقية البروتين القائم على كروماتوغرافيا تبادل الأنيونات: تقنية فصل لعزل بروتين ذي أهمية من محللة البكتيريا المحللة بالكلى بناء على صافي الشحنة

&lt; p class = "jove_content"&gt;في هذا الفيديو ، نوضح تنقية البروتين المرتبط بالكالسيوم من محللة الخلايا المحللة من خلال كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء المعتمدة على الكالسيوم. تكشف البروتينات المرتبطة بالكالسيوم عن منطقة كارهة للماء عند الارتباط بالكالسيوم ، مما يسهل التفاعل مع مجموعة كارهة للماء على الراتنج. في وقت لاحق يتم تصريف هذه البروتينات باستخدام مخلب الكالسيوم EDTA الذي يعكس التفاعل.

كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء المعتمدة على الكالسيوم: تقنية لتنقية البروتينات المرتبطة بالكالسيوم بناء على التفاعلات الكارهة للماء

هنا، نقدم طريقة للتعبير عن وتنقية S100A12 (كالغرانولين C). نحن تصف بروتوكول لقياس نشاطها المضادة للميكروبات ضد الممرض البشري H. بيلوري .

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

MALT1 ينظم الحصانة الفطرية ولكن كيف يحدث هذا وتظل غير محددة. كنا مثبط باراكاسباسي MALT1 انتقائية MLT-827 لكشف مساهمة MALT1 الفطرية مما يشير إلى المتلقين للمعلومات من مستقبلات يكتين مثل مثل عدد القتلى أو نوع ج، مما يدل على أن MALT1 وينظم إنتاج السيتوكينات النقوي، والمتلقين للمعلومات ج-نوع يكتين مثل مستقبلات، بشكل انتقائي.

تنظيم مسار الإشارات الفطرية النقوي بنشاط باراكاسباسي MALT1

في هذه الدراسة، نقدم على بروتوكول فعال لعزل الخلايا الليمفاوية ورواية من البقع في بير (PPs)، التي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لفحوصات الوظيفية في الجسم الحي وفي المختبر ، فضلا عن دراسات سيتوميتريك تدفق من تي جرابي مساعد وخلايا مركز جيرمنال ب.

كشف اللاعبين الرئيسيين من الحصانة Humoral: متقدم ومحسن اللمفاويات العزلة البروتوكول من بقع الفاري بير في

نحن نصف نموذج التحصين في الجسم الحي ، والتهاب الكبد الانتقالي في الفئران BALB / c التي يمكن استخدامها لدراسة التسبب في التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن المخدرات بما في ذلك الاختلافات بين الجنسين التي شوهدت في هذا المرض. سنصف كيف يوضح هذا النموذج التحليلات القابلة للتكرار باستخدام التقنيات التجريبية في الجسم الحي وفي المختبر.

تحريض التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن الأدوية في الفئران BALB / c لدراسة آلياته المسببة للأمراض

وترد هنا طريقة مفصلة تصف تنقية الجسيمات النانوية البروتينية ذاتية التجميع (SAPNs) وإعادة طيها وتوصيفها لاستخدامها في تطوير اللقاحات.

إنتاج E.القولونية - أعرب الذاتي تجميع البروتين الجسيمات النانوية لللقاحات التي تتطلب عرض الإبإبيلة الانتهازية

نقدم بروتوكولا بسيطا لعزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة من الدم الكامل الذي تم الحصول عليه من المرضى الذين تم تشخيصهم بمتلازمة سيزاري ، يليه اختيار الخلايا التائية CD4 + ، وتحفيزها باستخدام phorbol12-myristate13-acetate و A23187 ionophore ، وإعداد الحمض النووي الريبي للتنميط النسخي.

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

يقدم البروتوكول طرقا مفصلة لتقييم ما إذا كان المستحلب النانوي ophiopogonin D المساعد يعزز الاستجابات المناعية الخلوية الفعالة.

في المختبر تقييم النشاط الخلوي لمساعد لقاح المستحلب النانوي Ophiopogonin D

يتم تقديم بروتوكول فريد وشامل لتوليد خلايا متغصنة مشتقة من الخلايا الأحادية البشرية (mo-DCs) من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة (PBMCs) باستخدام علاج sialidase. علاوة على ذلك ، يتم وصف طرق تقييم التوصيف الظاهري والوظيفي ل mo-DCs وتقييم كيفية تحسين علاج sialidase لمستوى نضج mo-DCs.

توليد الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة مع أنماط ظاهرية مختلفة من السياليل

تعلم تنقية بروتين S100A12 البشري والأوليغوميرات الناتجة عن الأيونات لدراسة الاستجابات المناعية. تُستخدم هذه التقنية لتحفيز الخلايا الوحيدة وتطوير تدخلات علاجية جديدة.

تنقيه الS100A12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية

استكشف المزيد من الفيديوهات