عدوى السالمونيلا المزمنة الناجمة عن التليف المعوي

يصف هذا البروتوكول نموذج الماوس من التليف المعوي الذي يحركه السالمونيلا الذي يشبه السمات المرضية الرئيسية لمرض كرون بما في ذلك التهاب عبر الجدارية والتليف. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم العوامل المضيفة التي تغير النتائج الليفية باستخدام الفئران المتحولة التي تم الحفاظ عليها على خلفية وراثية C57Bl/6.

تليف الأنسجة هو الطريقة الأساسية التي تفشل فيها الأجهزة بمرور الوقت ، استجابة للالتهاب المزمن أو الشيخوخة. وفي الواقع، أود أن أزعم أنه إذا كنت لا تموت من عامل المعدية أو السرطان، عليك أن تموت على الأرجح من تليف الجهاز مع تقدمك في العمر. لسوء الحظ، ليس هناك الكثير من نماذج الماوس العظيمة لمحاكاة تليف الأنسجة البشرية.

لذا ما طورناه هو نموذج فأر لمرض كرون، هذا مرض في الإنسان يسبب تليف الأمعاء وغير قابل للعلاج إلى حد كبير. في الواقع، الطريقة الوحيدة التي يمكن علاجها هي من خلال الإزالة الجراحية للأنسجة الليفية وإعادة ربط الأمعاء. ميزة نموذجنا هو أنه penetrant تماما في جميع سلالات الماوس وأنه يحاكي عن كثب جدا مرض كرون الإنسان والتليف لا يزال قائما لأكثر من شهر، وهو في الحقيقة نموذج قوي.

الجزء الأكثر تحديا من هذا الإجراء هو التعامل مع الفئران وخاصة غافاج عن طريق الفم منذ ذلك يتطلب الكثير من شهادة الممارسة الخاصة. عند تنفيذ هذا الإجراء للمرة الأولى، ينبغي للمرء أن يدرك أن العمل مع السالمونيلا يتطلب احتياطات السلامة المناسبة وتقنية عقيمة. وينبغي أن يخطط للتخلص من النفايات والبكتيريا قبل التجربة.

إن العرض المرئي لهذا الإجراء مهم جداً لأنه ينطوي على التعامل مع السالمونيلا التي تتطلب احتياطات سلامة خاصة بالإضافة إلى تقنية معقمة مناسبة. لبدء هذا الإجراء، حدد لوحة مع LB agar تحتوي على ستريبتوميسين بتركيز 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. باستخدام حلقة التلقيح العقيمة، streak لوحة مع مخزون الجلسرين المجمدة من السهم دلتا S typhimurium أ.

احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. يمكن تخزين لوحات متتالية في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. قبل يوم واحد من الإصابة بالعدوى، قم بحل 0.5 جرام من ستريبتوميسين في 2.5 ملليلتر من الماء لإعداد المضاد الحيوي.

تصفية تعقيم حل ستريبتوميسين. ثم، استخدام لمبة يميل 22 مقياس غوفاج إبرة مع حقنة ملليلتر واحد لgavage شفويا الفئران مع 100 ميكرولترات من محلول الستربتوميسين. بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات من مرق LB تحتوي على ستريبتوميسين بتركيز 50 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى أنبوب الثقافة.

باستخدام حلقة تلقيح، تلقيح مرق LB مع مستعمرة واحدة. احتضان الثقافة الهوائية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة. في يوم العدوى ، قم بأداء اثنين متتاليين من واحد إلى 10 تخفيفات من ثقافات السالمونيلا بين عشية وضحاها مع PBS العقيمة لإعداد جرعة العدوى النهائية.

وهذا يؤدي إلى 100 microliter inoculum تحتوي على ما يقرب من ثلاثة ملايين مستعمرة تشكيل وحدات. بعد هذا، استخدام لمبة يميل 22 إبرة غافاج قياس مع حقنة ملليلتر لgavage كل فأر مع 100 ميكرولترات من السالمونيلا المعدة. أولا، المنصوص عليها اثنين milliliter آمنة قفل جولة أسفل الأنابيب الدقيقة، إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة وحبة الفولاذ المقاوم للصدأ autoclaved لكل أنبوب.

قبل وزن الأنابيب قبل جمع الأنسجة. بعد القتل الرحيم الفئران، استئصال أنسجة cecal وsplenic، والتأكد من جمع الأنسجة من الحيوانات الفردية في أنابيب منفصلة. وزن كل أنبوب لتحديد الأوزان الأنسجة.

استخدام جهاز مطحنة خلاط لتجانس الأنسجة في 30 هيرتز لمدة 15 دقيقة. ثم، نقل 900 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في كل بئر من كتلة 96-جيدا ميليلتر اثنين من ميغالتر. Pipette 100 ميكرولترات من تجانس الأنسجة في البئر الأول، ومزيج جيد.

تنفيذ عمليات تخفيف تسلسلية عن طريق إضافة 100 ميكرولترات إلى آبار لاحقة، حتى يتم الحصول على 10 إلى التخفيف السادس السلبي. لوحة 10 ميكرولترات من كل تخفيف في ثلاث ية على LB أجار الذي يحتوي على ستريبتومايسين. ثم، عد وحدات تشكيل مستعمرة متوسط وتحديد وحدات تشكيل مستعمرة لكل غرام من الأنسجة كما هو مبين في بروتوكول النص.

فتح فيجي، وهو برنامج التصوير مفتوحة المصدر وسحب وإسقاط ملف الصورة tif على شريط الأدوات. على شريط القوائم، حدد صورة، اكتب، رصة RGB لتقسيم الصورة إلى قنوات حمراء وخضراء وأزرق. قم بزلاقة الشريط الأفقي في أسفل اللوحة لتعيين القناة إلى اللون الأخضر.

افتح الصورة، ضبط، أداة العتبة. ضبط الحدود الدنيا والقصوى لإزالة أي إشارات الخلفية. بمجرد تعيين العتبة المطلوبة، قم بإغلاق أداة العتبة والذهاب إلى تحليل، تعيين القياسات، تحقق من المنطقة، والكسر المنطقة، والحد إلى عتبة وتسمية العرض.

الحصول على اختيار الأنسجة مع إما التحديدات اليدوي أو أداة التحديدات المضلعة وقياس نسبة مئوية منطقة إيجابية للكولاجين عن طريق النقر تحليل، قياس. ثم تطبيع المنطقة المطلقة إيجابية للكولاجين تلطيخ إلى منطقة الأنسجة. علاج ستريبتومايسين تليها عدوى فموية مع S التيثيموريوم دلتا السهم يؤدي إلى التهاب الأمعاء القوية والتليف، وخاصة في cecum.

ويمكن استرداد الأعباء النموذجية للأمراض من 100 مليون إلى مليار مستعمرة تشكيل وحدات لكل غرام من ال cecum من الحيوانات المصابة، في حين يمكن عادة 10 ألف مستعمرة تشكيل وحدات يمكن استردادها في غرام من الطحال. تقييم التليف في أقسام سيكال الملونة picrosirius الحمراء يشير إلى ذروة التليف بعد 21 يوما من العدوى ، في حين يتم حل الكثير من الأمراض بحلول اليوم 42 بعد العدوى. يعد الإعداد الدقيق للمواد أمرًا ضروريًا لأن هذه التجربة تتطلب عدة أيام للإعداد.

وينبغي أن يتم إعداد لوحات LB و السالمونيلا وStreptomycin جميع aseptically. قبل التجربة، تأكد من أن المجرب على دراية بالبروتوكول الحيواني وكذلك مخاطر السلامة. عند تقييم عبء الكولاجين، قد يختار المجرب إجراء فحوصات بيولوجية أخرى، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي لتقييم ملامح التعبير الجيني أو قياس تدفق الخلايا المناعية لتقييم المجموعات الفرعية للخلايا المناعية أو ELISA الأنسجة لتقييم لمحات السيتوكين.

لذا نموذجنا جيد بشكل خاص في تقليد مرض بشري يسمى مرض كرون حيث تحصل على تليف الأمعاء ، والذي لا يمكن علاجه إلى حد كبير والطريقة الوحيدة التي يمكنك علاجها هي إزالة جزء من الأمعاء وخيطه معًا مرة أخرى ونأمل ألا يعود. نموذجنا قوي جداً وقد أظهرنا بالفعل أن استهداف الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع الثالث، وهو عامل نسخ يسمى ألفا الخام، أو إنترلوكين 17 يخفف من المرض ويمنع التليف. نموذجنا جيد بشكل خاص في تحديد العوامل التي تلعب في التسبب في مرض كرون وتليف الأمعاء ونحن بالفعل على الطريق لتحديد عدد من الأهداف التي يمكن علاجها علاجيا للتخفيف من مرض الأمعاء الالتهابية.

وقد دخلت نموذجنا بالفعل في الوصول إلى ILC3 أو ألفا NIL17 قد يكون في اللعب في أمراض ليفية أخرى ، وتشمل هذه الأمور مثل الصدفية ، والتصلب المتعدد ، والتليف الرئوي مجهول السبب. لذلك فمن الممكن أن استهداف هذه العوامل نفسها قد يخفف من التليف في تلك الأمراض أيضا. على الرغم من أن تيار السالمونيلا المتحول ليس خبيثًا ، فمن المهم اتباع بروتوكولات السلامة الحيوية القياسية التي يقدمها المرفق.

أيضا، منذ أبخرة الفورمالديهايد معروفة لتكون مسرطنة، من المهم أن تعمل وراء غطاء الدخان خلال خطوة التثبيت.