توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية

هذا البروتوكول يجعل من الممكن ضمان عزل جيد من الخلايا خارج الخلية وإشعار من عدد أكبر من البروتينات EBDF. مقارنة مع تقنيات العزل الأخرى، هذا واحد يؤكد أنه أكثر سلامة وأنشطة عمودية. يتم دراسة المركبات الكهربائية أكثر فأكثر في LC وكذلك الحالات المرضية.

يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي أنظمة نختارها لتوصيف ودراسة المركبات الكهربائية. لهذا المحتوى أو الأخلاقيات البيولوجية مطلوب اهتمام خاص عند التكرار المركبات الكهربائية، كما هو الحال في نتائج الثقافة في التجارب التالية. إن العرض التوضيحي المرئي أمر بالغ الأهمية لاستضافة معدات محددة مثل عمود استبعاد اللوني للحجم محلي الصنع بالإضافة إلى مشاركة عداد الجسيمات النانوية ومطياف الكتلة.

المساعدة في إثبات الإجراء سيكون أنتونيلا رافو روميرو، أ من المختبر. ابدأ بعزل العُيْد خارج الخلية، أو المركبات الكهربائية، من متوسط الحالة. نقل الشرط إلى ثقافة المتوسطة من microglia أو الثقافات الضامة في أنبوب مخروطية والطرد المركزي في 1، 200 مرات G لمدة 10 دقائق ل بيليه الخلايا.

نقل المافق في أنبوب مخروطي جديد وطاردة مركزية لمدة 20 دقيقة أخرى للقضاء على الأجسام المبرمج. ثم نقل عظمى في أنبوب البولي 10.4 ملليلتر. ضع الأنبوب في دوار TI 70.1 وطاردة مركزية فائقة عند 100،000 مرة G لمدة 90 دقيقة في أربع درجات مئوية إلى بيليه المركبات الكهربائية.

بعد الطرد المركزي ، والتخلص من السوبر وإعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من 0.2 ميكرومتر تصفية برنامج تلفزيوني. لعزل المركبات الكهربائية، قم بإعداد عمود لوني محلي الحجم من خلال غسل وتعقيم عمود كروماتوغرافيا زجاجي، ووضع مرشح ميكرولتر 60 في الأسفل. كومة العمود مع ربط مصفوفات قاعدة أجاروز هلام الترشيح لإنشاء مرحلة ثابتة من 0.6 سم في القطر و 20 سم في الارتفاع.

ثم شطف المرحلة مع 50 ملليلتر من 0.2 متر ميكرو تصفية برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، قم بتخزين العمود عند أربع درجات مئوية لاستخدامها لاحقًا. ضع بيليه EV resuspended على رأس المرحلة الثابتة وجمع 20 كسور متتالية من 250 ميكرولترات مع الاستمرار في إضافة برنامج تلفزيوني إلى الجزء العلوي من المرحلة الثابتة.

ويمكن تخزين الكسور في ناقص 20 درجة مئوية. لإجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية، قم بتمييع كل كسر مع 0.2 ميكرومتر مصفى PBS ودوامة للقضاء على المجاميع. وضع الحل في حقنة ملليلتر واحدة ووضعه في مضخة الحقن الآلي.

بعد ذلك، قم بضبط إعدادات الكاميرا إلى مستوى كسب الشاشة المناسب ومستوى الكاميرا وانقر على تشغيل. قم بتحميل العينة في غرفة التحليل بمعدل ضخ 1000 لمدة 15 ثانية. ثم انقل وثبّت سرعة تدفق تسجيل الفيديو إلى معدل ضخ 25 لمدة 15 ثانية.

التقط ثلاثة مقاطع فيديو متتالية من 60 ثانية لتدفق الجسيمات. ثم ضبط مستوى الكاميرا وعتبة الكشف قبل تحليل الفيديو. انقر على "موافق الإعدادات" لبدء التحليل، وانقر على تصدير عند الانتهاء.

غسل النظام مع ملليلتر واحد من 0.2 ميكرومتر تصفية برنامج تلفزيوني بين كل كسر. إذا كان إجراء التحليل المجهري الإلكترون، استخدم مرشح الطرد المركزي 50 كيلو دالات لتركيز الكسور اللونية استبعاد حجم من الفائدة. لاستخراج البروتين، مزيج 50 ميكرولترات من العازلة RIPA مع عينة EV لمدة خمس دقائق على الجليد.

سونيكات العينات ثلاث مرات في 500 واط و 20 كيلوهيرتز لمدة خمس ثوان. ثم إزالة الحطام vesicular عن طريق الطرد المركزي في 20، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بعد عزل البروتينات، قم بإجراء هجرة البروتين في هلام التراص من هلام بولياكريليك 12٪.

اخلط البروتينات في الجل مع كوزي كوزي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يكوس كل قطعة هلام الملونة وقطع عليه إلى قطع صغيرة. ضع القطع الهلامية من خلال سلسلة من الغسلات المتتالية كما هو موضح في المخطوطة.

ثم جففها بالكامل مع تركيز فراغ. بعد التجفيف أداء خفض البروتين مع 100 ميكرولتر من 100 ميليمولاري بيكربونات الأمونيوم التي تحتوي على 10 ميليمولار ديثيوثريل لمدة ساعة واحدة في 56 درجة مئوية. المقبل أداء الألكيل البروتين مع 100 ميكرولترات من 100 ميليمولاري بيكربونات الأمونيوم التي تحتوي على 50 ملليمولار iodoacetamide لمدة 45 دقيقة في الظلام.

غسل القطع هلام وفقا لاتجاهات المخطوطات وتجفيفها تماما على المكثف فراغ. إجراء هضم البروتين مع 50 ميكرولترتر من التربسين في 20 ميليمولاري بيكربونات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استخراج البروتينات المهضمة من الجل مع 50 ميكرولترات من 100٪ ACN لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ثم 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اثارة مستمرة.

ثم استخراج البروتينات مرتين مع 50 ميكرولترات من 5٪ TFA في 20 ميليمولاري بيكربونات, في حين اثارة مستمرة لمدة 20 دقيقة. إضافة 100 ميكرولترات من ACN والاستمرار في اثارة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، جفف البروتينات و اِنْقِطها في 20 ميكرولترات من 0.1٪ TFA.

Desalt العينة باستخدام 10 طرف ماصة ميكرولتر مع C 18 وسائل الإعلام المرحلة العكسية لسالlting والببتيدات التركيز. ثم تُلَيّ لهم مع ACN و 0.1٪ حمض فشكل. تجف تماما العينة مع فراغ المكثف وإعادة تركيزه في 20 ميكرولترات من ACN و 0.1٪ حمض فشكلي لسائل الكروماتوغرافيا جنبا إلى جنب الطيف الشامل، أو LC-MS.

قم بتحميل الببتيدات المهضمة في الأداة وإجراء تحليل العينة. لتأكيد عزل EV ، تم إخضاع كل كسر SCC لتحليل تتبع الجسيمات النانوية. وكان عدد الجسيمات أعلى بكثير في الكسور خمسة وستة وسبعة.

تم تجميع هذه الكسور في عينة واحدة 2F-EV إيجابية، ومقارنة مع الكسور السلبية EV، 1F-EV السلبية و 3F-EV السلبية، وذلك باستخدام تحليل لطخة الغربية. وأظهرت النتائج وجود الحرارة صدمة البروتين 90 في العينة إيجابية EV وفي الخلية lysate السيطرة. أظهر المجهر الإلكتروني للعينة الإيجابية EV المركبات الكهربائية في نطاق حجم حول 100 نانومتر و 400 نانومتر.

وقد أُجري تحليل البروتيوميات من أجل تحديد البروتينات الملوثة في العينات السلبية من EV وتوصيف محتويات البروتين في المركبات الكهربائية. تم مقارنة البروتينات المحددة بين 1F-EV السلبية وعينات إيجابية 2F-EV، وكذلك بين 2F-EV إيجابية وعينات سلبية 3F-EV. وباستخدام هذه الطريقة غير المستهدفة، تم تقديم مجموعة من 536 بروتينًا إلى قاعدة بيانات ExoCarta وأدت إلى تحديد 86 بروتينًا من البروتينات المرتبطة بـ EV.

وبالإضافة إلى ذلك، سمح هذا المجمع أيضا بتحديد التفاعلات البروتينية والوظائف البيولوجية المرتبطة بها. ووجد أن البروتينات من العينة الإيجابية EV لعبت أدوارا في مسارات المناعة واعصاب. تم تقييم آثار المركبات الكهربائية المشتقة من ميكروجليا على نمو نيوريت مع خلايا PC 12 والخلايا العصبية الأولية الفئران.

ولوحظت زيادة كبيرة في النمو في إطار المركبات الكهربائية مقارنة بالسيطرة. تم تقييم المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة على غزو الخلايا الدبقية. وتبين أن المركبات الكهربائية أضعفت نمو وغزو ضرة الورم الدبقي.

أهم شيء يجب تذكره هو التخلص من ابر من الخطوة المفرطة من أجل منع فقدان المركبات الكهربائية في هذا الإجراء. نحن نفضل نهج واسع النطاق وغير محدد الهدف للتركيز على محتوى البروتين بأكمله ثم التأثير الرأسي للمركبات الكهربائية. لذلك يمكن أن تكون مرتبطة محتويات في الأحماض النووية باستخدام التحليل.

مع هذا النهج من ثقافة أولية، ونحن قادرون على التمييز بين البروتينات EV والبروتينات الحرة التي هي خارج من مجموعة متنوعة. ويبقى السؤال إذاً ما إذا كان هذا التخثر هو أثري أو بالأحرى بعض الحقيقي الآخر