توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية
يونيو 2, 2020
يسلط هذا التقرير الضوء على المتطلبات الزمنية لعزل الحويصلات خارج الخلية (EV) عن الميكروجليا أو الضامة الدموية. تم تقييم المركبات الكهربائية المشتقة من Microglia كجهات تنظيمية للنمو النيوريفي في حين تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة الدم في السيطرة على غزو خلايا الدبقي C6 في الاختبارات المختبرية. والهدف هو فهم أفضل لهذه الوظائف EV كوسطاء المناعة في بيئات دقيقة محددة.
هذا البروتوكول يجعل من الممكن ضمان عزل جيد من الخلايا خارج الخلية وإشعار من عدد أكبر من البروتينات EBDF. مقارنة مع تقنيات العزل الأخرى، هذا واحد يؤكد أنه أكثر سلامة وأنشطة عمودية. يتم دراسة المركبات الكهربائية أكثر فأكثر في LC وكذلك الحالات المرضية.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي أنظمة نختارها لتوصيف ودراسة المركبات الكهربائية. لهذا المحتوى أو الأخلاقيات البيولوجية مطلوب اهتمام خاص عند التكرار المركبات الكهربائية، كما هو الحال في نتائج الثقافة في التجارب التالية. إن العرض التوضيحي المرئي أمر بالغ الأهمية لاستضافة معدات محددة مثل عمود استبعاد اللوني للحجم محلي الصنع بالإضافة إلى مشاركة عداد الجسيمات النانوية ومطياف الكتلة.
المساعدة في إثبات الإجراء سيكون أنتونيلا رافو روميرو، أ من المختبر. ابدأ بعزل العُيْد خارج الخلية، أو المركبات الكهربائية، من متوسط الحالة. نقل الشرط إلى ثقافة المتوسطة من microglia أو الثقافات الضامة في أنبوب مخروطية والطرد المركزي في 1، 200 مرات G لمدة 10 دقائق ل بيليه الخلايا.
نقل المافق في أنبوب مخروطي جديد وطاردة مركزية لمدة 20 دقيقة أخرى للقضاء على الأجسام المبرمج. ثم نقل عظمى في أنبوب البولي 10.4 ملليلتر. ضع الأنبوب في دوار TI 70.1 وطاردة مركزية فائقة عند 100،000 مرة G لمدة 90 دقيقة في أربع درجات مئوية إلى بيليه المركبات الكهربائية.
بعد الطرد المركزي ، والتخلص من السوبر وإعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من 0.2 ميكرومتر تصفية برنامج تلفزيوني. لعزل المركبات الكهربائية، قم بإعداد عمود لوني محلي الحجم من خلال غسل وتعقيم عمود كروماتوغرافيا زجاجي، ووضع مرشح ميكرولتر 60 في الأسفل. كومة العمود مع ربط مصفوفات قاعدة أجاروز هلام الترشيح لإنشاء مرحلة ثابتة من 0.6 سم في القطر و 20 سم في الارتفاع.
ثم شطف المرحلة مع 50 ملليلتر من 0.2 متر ميكرو تصفية برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، قم بتخزين العمود عند أربع درجات مئوية لاستخدامها لاحقًا. ضع بيليه EV resuspended على رأس المرحلة الثابتة وجمع 20 كسور متتالية من 250 ميكرولترات مع الاستمرار في إضافة برنامج تلفزيوني إلى الجزء العلوي من المرحلة الثابتة.
ويمكن تخزين الكسور في ناقص 20 درجة مئوية. لإجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية، قم بتمييع كل كسر مع 0.2 ميكرومتر مصفى PBS ودوامة للقضاء على المجاميع. وضع الحل في حقنة ملليلتر واحدة ووضعه في مضخة الحقن الآلي.
بعد ذلك، قم بضبط إعدادات الكاميرا إلى مستوى كسب الشاشة المناسب ومستوى الكاميرا وانقر على تشغيل. قم بتحميل العينة في غرفة التحليل بمعدل ضخ 1000 لمدة 15 ثانية. ثم انقل وثبّت سرعة تدفق تسجيل الفيديو إلى معدل ضخ 25 لمدة 15 ثانية.
التقط ثلاثة مقاطع فيديو متتالية من 60 ثانية لتدفق الجسيمات. ثم ضبط مستوى الكاميرا وعتبة الكشف قبل تحليل الفيديو. انقر على "موافق الإعدادات" لبدء التحليل، وانقر على تصدير عند الانتهاء.
غسل النظام مع ملليلتر واحد من 0.2 ميكرومتر تصفية برنامج تلفزيوني بين كل كسر. إذا كان إجراء التحليل المجهري الإلكترون، استخدم مرشح الطرد المركزي 50 كيلو دالات لتركيز الكسور اللونية استبعاد حجم من الفائدة. لاستخراج البروتين، مزيج 50 ميكرولترات من العازلة RIPA مع عينة EV لمدة خمس دقائق على الجليد.
سونيكات العينات ثلاث مرات في 500 واط و 20 كيلوهيرتز لمدة خمس ثوان. ثم إزالة الحطام vesicular عن طريق الطرد المركزي في 20، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بعد عزل البروتينات، قم بإجراء هجرة البروتين في هلام التراص من هلام بولياكريليك 12٪.
اخلط البروتينات في الجل مع كوزي كوزي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يكوس كل قطعة هلام الملونة وقطع عليه إلى قطع صغيرة. ضع القطع الهلامية من خلال سلسلة من الغسلات المتتالية كما هو موضح في المخطوطة.
ثم جففها بالكامل مع تركيز فراغ. بعد التجفيف أداء خفض البروتين مع 100 ميكرولتر من 100 ميليمولاري بيكربونات الأمونيوم التي تحتوي على 10 ميليمولار ديثيوثريل لمدة ساعة واحدة في 56 درجة مئوية. المقبل أداء الألكيل البروتين مع 100 ميكرولترات من 100 ميليمولاري بيكربونات الأمونيوم التي تحتوي على 50 ملليمولار iodoacetamide لمدة 45 دقيقة في الظلام.
غسل القطع هلام وفقا لاتجاهات المخطوطات وتجفيفها تماما على المكثف فراغ. إجراء هضم البروتين مع 50 ميكرولترتر من التربسين في 20 ميليمولاري بيكربونات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استخراج البروتينات المهضمة من الجل مع 50 ميكرولترات من 100٪ ACN لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ثم 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اثارة مستمرة.
ثم استخراج البروتينات مرتين مع 50 ميكرولترات من 5٪ TFA في 20 ميليمولاري بيكربونات, في حين اثارة مستمرة لمدة 20 دقيقة. إضافة 100 ميكرولترات من ACN والاستمرار في اثارة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، جفف البروتينات و اِنْقِطها في 20 ميكرولترات من 0.1٪ TFA.
Desalt العينة باستخدام 10 طرف ماصة ميكرولتر مع C 18 وسائل الإعلام المرحلة العكسية لسالlting والببتيدات التركيز. ثم تُلَيّ لهم مع ACN و 0.1٪ حمض فشكل. تجف تماما العينة مع فراغ المكثف وإعادة تركيزه في 20 ميكرولترات من ACN و 0.1٪ حمض فشكلي لسائل الكروماتوغرافيا جنبا إلى جنب الطيف الشامل، أو LC-MS.
قم بتحميل الببتيدات المهضمة في الأداة وإجراء تحليل العينة. لتأكيد عزل EV ، تم إخضاع كل كسر SCC لتحليل تتبع الجسيمات النانوية. وكان عدد الجسيمات أعلى بكثير في الكسور خمسة وستة وسبعة.
تم تجميع هذه الكسور في عينة واحدة 2F-EV إيجابية، ومقارنة مع الكسور السلبية EV، 1F-EV السلبية و 3F-EV السلبية، وذلك باستخدام تحليل لطخة الغربية. وأظهرت النتائج وجود الحرارة صدمة البروتين 90 في العينة إيجابية EV وفي الخلية lysate السيطرة. أظهر المجهر الإلكتروني للعينة الإيجابية EV المركبات الكهربائية في نطاق حجم حول 100 نانومتر و 400 نانومتر.
وقد أُجري تحليل البروتيوميات من أجل تحديد البروتينات الملوثة في العينات السلبية من EV وتوصيف محتويات البروتين في المركبات الكهربائية. تم مقارنة البروتينات المحددة بين 1F-EV السلبية وعينات إيجابية 2F-EV، وكذلك بين 2F-EV إيجابية وعينات سلبية 3F-EV. وباستخدام هذه الطريقة غير المستهدفة، تم تقديم مجموعة من 536 بروتينًا إلى قاعدة بيانات ExoCarta وأدت إلى تحديد 86 بروتينًا من البروتينات المرتبطة بـ EV.
وبالإضافة إلى ذلك، سمح هذا المجمع أيضا بتحديد التفاعلات البروتينية والوظائف البيولوجية المرتبطة بها. ووجد أن البروتينات من العينة الإيجابية EV لعبت أدوارا في مسارات المناعة واعصاب. تم تقييم آثار المركبات الكهربائية المشتقة من ميكروجليا على نمو نيوريت مع خلايا PC 12 والخلايا العصبية الأولية الفئران.
ولوحظت زيادة كبيرة في النمو في إطار المركبات الكهربائية مقارنة بالسيطرة. تم تقييم المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة على غزو الخلايا الدبقية. وتبين أن المركبات الكهربائية أضعفت نمو وغزو ضرة الورم الدبقي.
أهم شيء يجب تذكره هو التخلص من ابر من الخطوة المفرطة من أجل منع فقدان المركبات الكهربائية في هذا الإجراء. نحن نفضل نهج واسع النطاق وغير محدد الهدف للتركيز على محتوى البروتين بأكمله ثم التأثير الرأسي للمركبات الكهربائية. لذلك يمكن أن تكون مرتبطة محتويات في الأحماض النووية باستخدام التحليل.
مع هذا النهج من ثقافة أولية، ونحن قادرون على التمييز بين البروتينات EV والبروتينات الحرة التي هي خارج من مجموعة متنوعة. ويبقى السؤال إذاً ما إذا كان هذا التخثر هو أثري أو بالأحرى بعض الحقيقي الآخر
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تفصل هذه الدراسة البروتوكولات اللازمة لعزلة الجسيمات خارج الخلية (EVs) من الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم الدموية، مع التركيز على أدوارها في تنظيم نمو النهايات العصبية والتحكم في غزو خلايا الورم الدبقي. تهدف النتائج إلى تعزيز فهمنا لوظائف EV كوسطاء مناعية ضمن بيئات محلية محددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
الخلفية
- تلعب الجسيمات خارج الخلية (EVs) أدوارًا مهمة في التواصل بين الخلايا.
- الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم هي خلايا مناعية حاسمة في الجهاز العصبي المركزي.
- فهم كيفية تأثير EVs على وظائف الخلايا العصبية يمكن أن يوفر رؤى حول التفاعلات العصبية المناعية.
- يمكن أن تؤثر تقنيات عزل EV الحالية على سلامة ونشاط الجسيمات.
هدف الدراسة
- لتقييم EVs المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم الدموية في سياقات بيولوجية مختلفة.
- لتقييم تأثير هذه EVs على نمو النهايات العصبية وسلوك خلايا الورم الدبقي.
- لوضع بروتوكولات موثوقة لعزل EV تضمن السلامة البيولوجية.
الطرق المستخدمة
- تتضمن الطريقة الأساسية زراعة الخلايا متبوعة بفصل التخمير التدريجي لعزل EVs من الوسط المكيف.
- يتم استخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية وتقنيات Western blot لتوصيف EV.
- تشمل التفاصيل التخمير الفائق، كروماتوغرافيا استبعاد الحجم، وأساليب استخراج البروتين.
- يتم إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على الأخلاقيات البيولوجية أثناء التعامل مع EV.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة عدد جزيئات أعلى بشكل ملحوظ في الكسور المحددة الغنية بـ EVs.
- أكدت تحليلات Western blot وجود بروتينات تتعلق بالإجهاد القلبي في العينات الإيجابية لـ EV.
- حدد المجهر الإلكتروني نطاق حجم الجسيمات المعزولة، مما يشير إلى نجاح طرق العزل.
الاستنتاجات
- قد تعزز البروتوكولات المطورة لعزل EV من الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم البحث في العمليات التنموية العصبية المناعية.
- توفر الدراسة إطارًا للتحقيقات المستقبلية في أدوار EV في سياقات بيولوجية مختلفة.
- يمكن أن يساهم فهم الدلالات الوظيفية لهذه EVs في وضع استراتيجيات علاجية في الأمراض العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Isolation and functional characterization of immune cell-derived extracellular vesicles (EVs) enable mechanistic de-risking in neuroimmunology and oncology target validation. This approach supports predictive confidence in therapeutic vesicle design by linking EV protein signatures to neurite outgrowth and glioma invasion phenotypes. The protocol provides a scalable, reproducible workflow for evaluating EV-mediated immune functions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial and macrophage EV protein signatures as biomarkers for immune-mediated pathway modulation.
- Operational Value: Provides standardized isolation via ultracentrifugation and size-exclusion chromatography to ensure EV integrity for functional assays.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating EV-enriched proteins (e.g., HSP90) with functional outcomes in neurite outgrowth and glioma spheroid invasion models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative nanoparticle tracking data from SEC fractions to standardize EV yield and purity across batches.
- Operational Value: Enables functional readouts in neurite outgrowth (PC12/primary neurons) and glioma invasion (C6 spheroids) assays for immune mediator screening.
- Assay Readiness: Pooled EV-positive fractions (5-7) provide consistent material for downstream proteomic and functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant EV functions in neurite outgrowth (neuroprotection) and glioma invasion (anti-tumor immune modulation).
- Translational Continuity: Links EV protein cargo to immune and neuroprotective pathways, supporting biomarker-aligned mechanistic studies.
- Preclinical Model Utility: Uses primary neurons and glioma spheroids to evaluate EV effects in physiologically relevant culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of immune cell EVs as modulators of neuronal and cancer cell phenotypes, supporting lead identification through functional de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of EV-mediated immune signaling in CNS and tumor microenvironments via isolated vesicle functional assays.
- Screening: Delivers standardized, quantification-ready EV preparations for high-content phenotypic screening in neurite outgrowth and invasion models.
- Analytics: Generates nanoparticle tracking, Western blot, and proteomic data to quantify EV yield, validate markers (e.g., HSP90), and characterize functional protein cargo.
- Translational Research: Connects EV protein signatures to pathway-level effects in neurite outgrowth and glioma invasion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and characterization platform applicable to multiple immune cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of immune cell EV functions in neurite outgrowth and glioma invasion models.
- Operational Value: Standardized isolation via ultracentrifugation and SEC ensures reproducibility and scalability across labs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking EV protein signatures to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic vesicle candidates based on functional immune mediator validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, ultracentrifugation, and size-exclusion chromatography for EV isolation.
- Dependent on nanoparticle tracking analyzers, Western blot systems, and mass spectrometry for EV characterization.
- Necessitates cross-team standardization of EV fractionation and pooling (e.g., fractions 5-7) for reproducible functional assays.
- Adaptation to primary microglia, macrophages, or other immune cells requires validation of EV yield and functional activity.
- Practical limitation: EV integrity depends on careful supernatant removal post-ultracentrifugation to prevent loss of vesicle yield.
